论文部分内容阅读
研究背景和目的:非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver,NAFLD)是全球最常见的慢性肝病之一。NAFLD呈渐进性发展,包括至少三个不同阶段—单纯性脂肪肝(simple fatty liver,SFL),非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)以及肝硬化。脂肪变性是指除脂肪细胞外的实质细胞内出现脂滴或脂滴明显增多的现象,重度肝脂肪变性称为脂肪肝(fatty liver,FL),进一步可引起炎症改变,肝肿大和肝功能异常。随着人们生活习惯以及摄入过量高脂高胆固醇饮食,非酒精性肝脂肪变性的发生率显著升高。ABCG5和ABCG8属于ATP结合盒(ATP binding cassette,ABC)转运蛋白家族的成员,在非病理状态下对肝肠胆固醇分泌排泄至关重要,是机体维持胆固醇稳态的的主要手段之一。已有文献报道肝组织中胆固醇类代谢异常,游离胆固醇增加与NAFLD的发生发展密切相关,但ABCG5和ABCG8对大鼠肝脏胆固醇代谢、NAFLD形成的具体作用和机制仍不清楚。本研究旨在探讨ABCG5、ABCG8在高脂诱导SD大鼠肝脂肪变性中的作用及其机制。实验方法:1.利用CRISPR/Cas9打靶技术制备全身性敲除ABCG5和ABCG8大鼠,PCR鉴定是否构建成功。2.将8周的野生型(WT)大鼠和ABCG5/ABCG8敲除(KO)大鼠分别为两组:(1)正常饮食(ND)组;(2)高脂饮食(HFD)组,喂养14周,观察各组大鼠的体重变化,采用TSE小动物代谢笼检测食物摄取量的差异。3.收取每只大鼠肝脏进行固定、石蜡切片和HE染色来观察脂肪的积累,并检测肝脏和血清的脂质含量。通过血清中转氨酶的水平分析肝功能。4.采用RT-PCR技术分析基因ABCG5、ABCG8、CYP7A1、CYP27A1、NPC1L1、CD36在mRNA水平上的表达情况;Western blot检测大鼠肝脏中胆固醇和脂肪酸合成、代谢相关蛋白的表达情况,如HMGCR、NPC1L1、CD36、SREBP1、ACC、FASN。结果:1.ABCG5、ABCG8在SD大鼠肝脏和小肠组织中高表达,在心脏、脾、肺、肾组织几乎没有表达。2.基因型鉴定和RT-PCR测定显示ABCG5/G8 KO大鼠在肝脏和小肠中未检测到ABCG5/G8的表达。3.高脂喂养14周后,ABCG5/G8敲除显著缓解高脂喂养引起的体重增加和肝脏脂肪、胆固醇堆积,血清胆固醇含量亦明显降低;但两组的糖耐量(IPGTT)和转氨酶在正常范围;未见明显的炎性细胞浸润;提示大鼠的NAFLD病理改变处于肝脂肪变性期。4.高脂饮食下调肝、肠组织基因ABCG5、ABCG8的表达,明显抑制肝组织SREBP1、ACC、FASN的表达。ABCG5/G8缺失明显增加肝组织CYP27A1表达,显著抑制高脂介导的肝组织HMGCR、NPC1L1、CD36表达。同时,ABCG5/G8缺失明显抑制小肠NPC1L1、CD36的表达。结论:ABCG5/G8敲除显著缓解高脂喂养引起的体重增加,明显减少高脂喂养介导的肝脏胆固醇、脂肪堆积。ABCG5/G8缺失增加肝组织CYP27A1表达,显著抑制高脂介导的肝组织HMGCR、NPC1L1、CD36表达,从而减少肝组织胆固醇的合成与摄取,减少脂肪酸摄取,促进胆固醇的胆汁排泄。