Hedgehog信号通路配体Shh在肺鳞癌中发病的分子机制

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背景:  肺癌的发病率很高,至今仍然是癌症死亡的主要原因。根据组织学特点,可以将肺癌分为两大类:非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)。NSCLC主要分为肺腺癌(AC)和肺鳞状细胞癌(SCC)。SCC约占非小细胞肺癌的30%,吸烟与鳞状细胞癌高度相关。近年来,化学治疗仍是治疗肺鳞癌的主要方法。虽然在肺鳞状细胞癌中, FGFR,DDR2和PI3K/mTOR通路等被发现有致癌性的改变,但仍需寻找有效的靶向治疗方法。  最近研究显示,在多种肿瘤中Hedgehog(Hh)信号通路异常激活。 Hh信号与癌症中多种生物学过程密切相关。Hh信号对脊椎动物发育至关重要,例如肺的发生。尽管一些研究显示Hh信号通路激活与非小细胞肺癌发生发展相关,但是Shh在肺鳞癌中的作用仍然知之甚少。GATA6是GATA转录因子家族的一员,GATA转录因子含有进化上保守的C2型锌指DNA结合结构域,其与WGATAR序列结合。GATA家族包含六名成员,即GATA1/2/3/4/5/6。GATA1/2/3主要在造血系统中表达,而GATA4/5/6在包括肠,肝和肺的许多器官中表达。虽然有研究报道GATA6能调节Hh信号通路的活性,条件性删除GATA6会导致Shh及其下游靶基因的表达。然而,在肺鳞癌中GATAs调控Shh表达的机制仍需进一步研究。在我们的研究中,我们发现Shh在肺鳞癌组织中上调,其可以通过旁分泌和自分泌方式促进肺鳞癌细胞的迁移和侵袭。进一步的机制研究发现,GATA6通过与Shh基因的启动子结合,从而抑制Shh的表达。GATA6在肺鳞癌组织中特异性的下调,其在肺鳞癌细胞中能通过抑制Shh的表达抑制细胞的迁移和侵袭。  目的:  1、探索在肺鳞癌中Shh配体高表达的分子机制,明确Shh对肺鳞癌发病的作用;  2、揭示调节Shh表达水平对肺鳞癌细胞迁移和侵袭的影响,为肺鳞癌的临床治疗提供新的干预手段  方法:  1、临床组织标本检测  1)收集病理诊断数据,筛选无其他疾病、手术前无放化疗的肺鳞癌患者组织样本111例。  2)将收集的标本固定,用免疫组化实验检测Shh的含量。  2、使用外源N-Shh刺激肺鳞癌细胞,通过Transwell和划痕实验观察肺鳞癌细胞的侵袭和迁移能力的变化。  3、使用慢病毒在SK-MES-1、H226细胞中干扰或过表达Shh,通过Transwell实验观察肺鳞癌细胞的侵袭和迁移能力的变化。  4、生物信息学分析GATA6在肺鳞癌中的表达情况,Westernblot和QPCR实验检测GATA6对Shh表达的调控,Transwell实验检测GATA6对Shh诱导的肺鳞癌细胞侵袭和迁移的影响。  5、通过双荧光素酶报告基因和染色质免疫共沉淀实验探索GATA6调节Shh表达的机制。  结果:  1、临床组织标本检测结果显示:与对照相比Shh配体在肺鳞癌组织中相对高表达,Shh的水平与肺鳞癌病人的存活率成反比。  2、Transwell和划痕实验结果显示外源的N-Shh可以增强肺鳞癌细胞的侵袭和迁移能力。  3、Transwell实验结果显示Shh高表达可以增强肺鳞癌细胞的侵袭和迁移能力,干扰Shh后肺鳞癌细胞的侵袭和迁移能力下降。  4、在肺鳞癌中GATA6表达量低,GATA6高表达抑制Shh表达且细胞迁移和侵袭能力降低。  5、双荧光素报告基因和染色质免疫共沉淀实验结果显示GATA6是Shh上游调控Shh表达的抑制性转录因子。  结论:  Shh在肺鳞癌组织中高表达,Shh的表达水平与肺鳞癌病人的生存率成反比,Shh的表达水平越高,生存率越低。Shh配体通过旁分泌和自分泌的形式促进肺鳞癌细胞的迁移和侵袭。进一步的机制研究发现,GATA6在肺鳞癌组织中特异性低表达,GATA6通过转录抑制Shh的表达从而抑制肺鳞癌细胞的迁移和侵袭。
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