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背景：如同其它的真核细胞，心肌细胞的结构和功能完整有赖于由微丝、微管和中间丝组成的分布广泛的骨架蛋白。结蛋白(desmin，des)是心肌主要的中间丝蛋白。结蛋白表达上调常见于心肌肥厚和充血性心力衰竭等疾病，而结蛋白突变则可引起结蛋白相关心肌病(desmin-related cardiomyopathy，DRC)和扩张性心肌病。 DRC是结蛋白相关肌病(desmin-related myopathies，DRM)在心脏上的表现。DRM为一散发、家族性的有不同临床表现的神经肌肉疾病，其特点为肌细胞内结蛋白病理性增加。心脏损害主要表现为传导异常、心律失常和充血性心力衰竭。尽管DRM可牵涉到横纹肌和平滑肌，但通常仅心肌或心肌和骨骼肌受到影响，而且心肌病往往是死亡的主要原因。到目前为止，结蛋白基因和α-B-Crystallin(CryAB)的突变被认为与DRM有关。CryAB作为晶状体主要的结构蛋白，具有分子伴侣活性，在其它蛋白质处于易感状态时，可保护其免受损伤，主要表现为抑制各种蛋白质的凝聚和酶的失活。由于在DRM的结蛋白异常聚积物中常伴有CryAB和泛素(ubiquitin，Ub)，因此泛素蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system，UPS)可能参与了DRM的发病机制。UPS是细胞内ATP依赖的非溶酶体蛋白降解机制，可高效并高度选择性地降解细胞内蛋白质，在应激状态下也降解细胞内结构蛋白。在Alzheimer、Parkinson、Huntington和Creutzfeldt-Jakob等几乎所有的神经退化性疾病的细胞内都可见到Ub化聚积物，UPS功能抑制。UPS突变与神经退化性疾病和先天性心脏病有关。然而DRC的异常蛋白聚积物是否损害USP功能，以及它们之间的因果关系目前尚不清楚。 闰盘是心肌电、机械和代谢耦联的结构基础。它是由非特化肌膜、粘合膜、桥粒和缝隙连接组成的特殊结构。粘合膜和桥粒与心肌机械耦联有关，而缝隙连接参与了心肌的化学耦联和电耦联。在粘合膜，肌动蛋白(actin)通过结合α-actinin、Vinculin、α-catenin(α-cat)、β-Catenin(β-Cat)和γ-catenin(γ-cat)，与N-Cadherin(N-cad)相连接，从而强化细胞间的粘附。由于肌原纤维附着在粘合膜，这使收缩信号可沿胞浆膜扩布。桥粒由Cadherins、Armodilla家族和plakins三种超家族组成，在心肌和表皮上广泛存在。南京医科大学博士学位论文Cadherin:家族的desmoglein和desmocolin通过桥粒斑蛋白(desmoPlakin，DP)和Plakoglobin(PG，also named as犷ea tenin，丫一cat)与中间丝如结蛋白(desmin)相连接，提供心肌结构支持。缝隙连接允许相邻细胞间离子、代谢物和其它信号分子通过由connex ins(Cxs)组成膜通道转运，调节着细胞与细胞之间的电流的扩布。成年心肌组织主要含有connex in40(Cx40)、Cx43和Cx45。由于结蛋白丝在闰盘纵向插入桥粒，因此DRC紊乱的结蛋白网可能会破坏桥粒结构和功能的完整并进而影响闰盘的其它结构，导致闰盘重塑。 目的:1.研究突变结蛋白(D7一des)转基因小鼠心脏UPs功能，以及异常的蛋白积聚物与UPS损害之间的关系。2.研究R120G一aB一crys ta川n(RlzoG一eryAa)转基因小鼠心脏uPS功能，以及异常的蛋白积聚物与uPS损害之间的关系。3.研究CryAB是否可减少突变结蛋白引起的蛋白积聚和改善UPS功能.4.研究D7一des转基因小鼠的闰盘重塑。5.研究R120G一CryAB转基因小鼠的闰盘重塑。 方法:1.取07一des转基因小鼠和R120G一CryAB转基因小鼠的心肌，提取蛋白，通过We 5 t e r n b 1 ots观察心室Ub化蛋白并测定蛋白酶体肤酶活性。2.PCR扩增野生型和突变型结蛋白(WT一des和D7一des)cDNA以及野生型和突变型CryAB(WT一CryAB和R120G一CryAB)cDNA，将它们首先克隆到ToPoTA载体，胶切纯化后，再亚克隆到PEGFP一c1质粒，构建真核细胞结蛋白和CryAB表达载体。3.将含有UPS底物GFPu质粒稳定转染HEK293细胞，筛选细胞，建立稳定表达GFPu的GFPu一1细胞系。4.用限制性内切酶切割WT一cryAB质粒和G FPu质粒，T4DNA连接酶连接，构建含有WT一CryAB和GFPu的融合表达质粒(CryAB一GFPu)。5.将CryAB一GFPu转染HEK293细胞，建立稳定表达wT一eryAB和eFPu的GFPu一2细胞系。6.将WT一des或D7一des质粒短暂转染GFPu一细胞，通过Western bl。ts和免疫标记共聚焦显微镜观察蛋白积聚和GFPu关系。7.将wT一CryAB或R120G一CryAB质粒短暂转染GFPu一细胞，通过Wes tern blots和免疫标记共聚焦显微镜观察蛋白积聚和GFPu关系。8.将wT一des或D7一des质拉短暂转染GFPu一细胞，通过Wes tern blots和免疫标记共聚焦显微镜观察蛋白积聚和GFpu关系。9.提取 D7一des转基因小鼠和R12oe一eryAB南京医科大学博士学位论文转基因小鼠心室组织蛋白，通过Wes t e r n b 1 0 ts和免疫标记共聚焦显微镜观察闰盘相关蛋白分布和表达的变化。 结果:1.D7一des(l)D7一des转基因小鼠心肌组织有Ub化蛋白积聚，在1个月时就开始升高，6个月达到峰值;使用荧光底物n和m检测体外的D7一des和WT一des的蛋白酶体肤酶活性。与WT一des和非转基因动物(NTG)比较，D7一des心肌匀浆可溶性蛋白部分蛋白酶体肤酶活性没有改变，进一步