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水稻生产面临着包括稻瘟病、白叶枯病、稻曲病等多种病害的威胁,抗病育种在提高水稻抗性、保障粮食安全中具有重要作用。我们在粳稻材料Kitaake的转基因后代中分离得到一份抗性增强的水稻类病斑突变体,将其命名为lrd6-6。我们成功克隆了该基因,解析了 AAA ATPase LRD6-6参与水稻细胞死亡及免疫反应调节的分子机制,并对将该基因应用于水稻抗病育种进行了探索。具体研究结果如下:1.对lrd6-6进行了详细的表型鉴定,揭示了类病斑表型是细胞死亡积累的结果,发现突变体lrd6-6中积累了大量的H2O2。2.鉴定了 的抗病性,发现其对真菌病害稻瘟病和细菌性病害白叶枯的抗性增强。3.通过图位克隆,结合全基因组重测序,我们在突变体基因LOCOs06g03940中鉴定出了一段1446 bp核酸序列重复;通过RNAi及遗传互补试验我们证明该基因即为目的基因Lrd6-6。4.Lrd6-6基因在水稻全生育期所选的各组织部位均有表达,随着植株的生长其表达量增加,且在叶片中表达量最高;LRD6-6蛋白与MVBs标记蛋白RabF1/RAR6共定位,证明LRD6-6定位于植物多泡体MVBs上;同源比对发现与LRD6-6同源的AAAATPase主要功能为参与MVBs的形成及其介导的囊泡运输:根据同源基因相关报道我们鉴定了 LRD6-6中三个氨基酸保守位点K261、E315和R372,并构建了相应的 LRD6-6 点突变 LRD6-6K261A、LRD6-6E315Q和 LRD6-6R372E表达相关载体。5.通过原核表达我们纯化了 LRD6-6及三个保守氨基酸位点点突变的蛋白,并测定了这些蛋白的体外ATPase活性,结果表明LRD6-6是一个有功能的ATPase,三个保守位点氨基酸的突变致使LRD6-6丧失了 ATPase活性;通过酵母双杂交和BiFC试验我们证明LRD6-6能够形成同源二聚体,LRD6-6K261A和 LRD6-6E315Q点突变体也能形成同源二聚体,而R372E突变导致LRD6-6丧失了形成同源二聚体的能力;通过这些点突变体在lrd6-6中的表达我们证明氨基酸位点突变体LRD6-6K261A、LRD6-6E315Q和LRD6-6R372E的体内生物学功能丧失。6.有趣的是,与同源基因报道结果类似,我们发现LRD6-6E315Q突变体能够与野生型LRD6-6蛋白相互作用,在野生型水稻Kitaake中表达LRD6-6E315Q能够表现显性负调控效应,促使过表达植株出现类似lrd6-6的细胞死亡及免疫激活现象,这为育种上利用该基因提供了很好的材料及基础。7.转录组分析（RNA-seq）在野生型和lrd6-6突变体中共检测到1223个差异表达的基因（DEGs）;GO分析将这些DEGs主要分类到了一些与MVBs形成及运输相关的细胞组分中;拟南芥液泡羧肽酶Y（Carboxypeptidase Y,AtCPY）融合GFP蛋白在野生型和突变体lrd6-6以及lrd6-6转Os06g03940-11.5 kb互补植株和Lrd6-6E315Q表达植株原生质体中的瞬时表达观察,结合渥曼青霉素处理,进一步证实突变体MVBs介导的囊泡运输过程出现了障碍。8.DEGs代谢途径（Pathway）分析发现差异表达基因主要富集在负责合成次级抗菌代谢物血清素、木质素和抗毒素的三条代谢途径即Phenylpropanoid biosynthesis（ko00940）、Diterpenoid biosynthesis（ko00904）和 Phenylalanine,tyrosine and tryptophan biosynthesis（ko00400）中;通过基因表达量分析和对木质素、抗毒素含量的测定证明这些抗菌代谢物确实在lrd6-6中出现了积累,并在互补植株中得到了恢复,而在Lrd6-6E315Q过表达植株中也出现积累。9.酵母双杂交文库筛选获得了 LRD6-6互作蛋白OsSNF7,OsSnf7编码一个ESCRT-Ⅲ复合体组件SNF7同源蛋白,预测与MVBs的形成有关;通过CRISPR/Cas9介导的基因敲除技术我们在Kitaake中成功敲除OsSnf7基因,遗憾的是OsSnf7敲除并未引起后代植物出现不同于野生型的表型;分析发现水稻中至少还有两个Snf7同源基因可能与OsSnf7具有功能冗余,要研究水稻Snf7基因功能后续需要构建这三个Snf7同源基因的两突或三突突变体。随后我们还鉴定出了 VPS2水稻同源基因并证明OsVPS2能够与LRD6-6相互作用,进一步支持了 LRD6-6参与囊泡运输的结论。叶绿体是植物将光能转化为化学能并释放人类赖以生存的氧气的场所。DnaJ分子伴侣蛋白属于Hsp40家族,已有的报道显示DnaJ分子伴侣家族蛋白在植物的多种细胞器组分中发挥作用,参与了植物生长发育中多方面的调控。对植物叶绿体中DnaJ基因的研究显示,叶绿体DnaJ蛋白对其自身的发育调控、功能行使及植物耐逆性都有重要作用。水稻是重要的粮食作物,但水稻中关于DnaJ家族分子伴侣蛋白的报道极少。本研究筛选了水稻基因组中预测编码叶绿体DnaJ蛋白的基因,对这些基因进行分析发现LOCOs05g26902及LOCOs05g26926两个基因编码完全一致的蛋白,且基因启动子中预测的顺式作用元件类型、功能一致,因此我们推测该DnaJ蛋白在水稻叶绿体中具有重要的功能,将这两个基因命名为OsDjA7/8。OsDjA 7/8在水稻各组织部位均有表达,在旺盛生长的组织、时期表达量较高。OsDjA7/8蛋白主要定位在水稻叶绿体中,暗示该蛋白主要在叶绿体中发挥功能。对该基因表达量进行抑制会导致转基因植株出现白化致死表型。进一步通过透射电镜观察我们发现OsDjA 7/8表达量抑制的植株叶绿体及细胞结构异常;同时我们发现这些转基因植株中叶绿体发育相关标记基因Cab1R、Cab2R、PsaA和PsbA表达受到抑制,说明OsDjA7/8表达量的抑制严重影响了水稻叶绿体的发育。综上所述,我们证明DnaJ蛋白OsDjA7/8是水稻叶绿体发育必不可少的调控因子。