目的阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）病理学的突出特征是淀粉样β蛋白（Amyloid β βrotein,Aβ）在大脑区域如海马和大脑皮层聚集沉积形成老年斑以及整个脑中出现胆碱能神经元和烟碱型乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receβtors,nAChRs）的丢失。目前AD确切的发病机制还不清楚,近年来,Aβ与α7-nAChR结合及其相互作用的生物相关性被广泛研究。已有的研究表明,在Aβ浓度病理性增加的情况下,这种相互作用可能导致AD的发生。然而,之前的研究很少涉及Aβ_1-42对锥体神经元和中间神经元直接的作用,以及Aβ_1-42与两种神经元上α7-nAChR相互作用关系的异同。为此,本研究探讨Aβ_1-42对大鼠海马CA1区锥体神经元和中间神经元膜电流及兴奋性的影响;并研究探讨Aβ_1-42与锥体神经元和中间神经元上α7-nAChR相互作用关系以及这种相互作用关系的异同以致对神经元网络功能的影响,进一步研究Aβ导致中枢神经元毒性损伤,引起中枢胆碱能系统功能紊乱甚至神经元网络功能紊乱的途径和机制,为进一步了解AD的发病机理及对AD的防治提供新的思路。方法1.制备SD大鼠（14-18d）海马脑片（300μm）,利用脑片膜片钳系统红外微分干涉相差显微镜从神经元所在海马CA1区的位置、胞体的大小和形状、轴突和树突的形态及走向等特征初步鉴别锥体神经元和中间神经元。利用可视脑片膜片钳法,对大鼠海马CA1区锥体神经元和中间神经元分别采用全细胞电压钳和电流钳记录模式,研究锥体神经元和中间神经元电生理学特征及其差异。2.利用α7-nAChR特异性激动剂choline和选择性拮抗剂甲基牛扁亭碱（methyllycaconitine,MLA）分别在全细胞电压钳和电流钳记录模式下检测两种神经元的膜电流和膜电位,包括动作电位（action potential,AP）发放频率的变化,检测α7-nAChR在两种神经元上的电生理学功能性表达情况。3.选用各浓度的Aβ_1-42通过程控加药系统加药短暂作用于海马CA1区锥体神经元、中间神经元,全细胞电压钳、电流钳记录模式分别检测Aβ-42诱导的两种神经元膜电流和膜电位变化。用MLA拮抗α7-nAChR后检测其对Aβ_1-42诱导的两种神经元膜电流和膜电位变化的影响。4.用0.1、1、10nM相对低浓度的Aβ_1-42分别灌流作用海马CA1区锥体神经元、中间神经元,全细胞电流钳记录模式检测灌流作用1、β、5、7、9min,两种神经元对所钳制的阶跃递增式去极化钳制电流诱发的膜电位变化及APs发放,并观察Aβ_1-42对锥体神经元和中间神经元兴奋性影响的时间相关性。5.选用lnMAβ_1-42灌流作用海马脑片30min后,检测在Aβ_1-42更长时间作用下,两种神经元对所钳制的阶跃递增式去极化钳制电流诱发的膜电位变化及APs发放。并使用 MLA 及 AP5、DNQX、bicuculline,检测 α7-nAChR、NMDAR、AMPAR、GABAAR被拮抗后对该作用的影响。6.lnMAβ_1-42分别灌流作用于锥体神经元和中间神经元,在全细胞电流钳记录模式下,给神经元施加-100pA-100pA连续递增的钳制电流,使神经元逐渐去极化并爆发APs,分别检测锥体神经元和中间神经元的静息膜电位,并测定开始爆发AP时所对应的神经元阈电位值。观察Aβ_1-42长时间作用后对海马CA1区锥体神经元、中间神经元静息电位和阈电位的影响。7.脑片膜片钳电压钳记录模式检测lnM Aβ_1-42灌流作用下对100mM choline诱发的锥体神经元、中间神经元膜电流影响。电流钳记录模式检测Aβ_1-42灌流作用后0.1mM choline灌流作用引发的锥体神经元和中间神经元兴奋性变化。比较Aβ_1-42单独作用、choline单独作用和Aβ_1-42与choline共同作用下海马CA1区这两种神经元的兴奋性变化。结果1.大鼠海马CA1区锥体神经元和中间神经元所在海马区域的位置、胞体、轴突和树突的形态及走向具有差异;通过脑片膜片钳技术,发现这两种神经元静息膜电位、阈电位、膜阻抗、动作电位发放频率、幅度等电生理特征方面也存在明显差异。通过观察神经元位置和形态结合脑片膜片钳技术可对这两种神经元加以比较和鉴别。2.α7-nAChR特异性激动剂choline在电压钳记录模式下能诱导海马CA1区锥体神经元和中间神经元的细胞膜内向电流,也能在电流钳记录模式下兴奋海马CA1区锥体神经元和中间神经元,这种作用与浓度呈正相关。α7-nAChR选择性拮抗剂MLA能显著抑制choline诱导的两种神经元上的膜内向电流和APs发放频率。结果表明α7-nAChR在大鼠海马CA1区锥体神经元和中间神经元上均呈现功能性表达。3.高浓度Aβ_1-42可直接诱导锥体神经元产生内向膜电流,并使锥体神经元过兴奋,这种作用可被MLA部分抑制。而对中间神经元,各浓度Aβ_1-42未能诱导产生内向膜电流,也不能使中间神经元的兴奋性增强。4.在灌流作用下,对应各钳制电流,低浓度Aβ_1-42可使锥体神经元兴奋性增高,随Aβ_1-42浓度增加,Aβ_1-42诱导锥体神经元单位时间内爆发的APs愈多。MLA可减弱Aβ_1-42致锥体神经元兴奋性增强的作用。AP5、DNQX、bicuculline分别拮抗NMDAR、AMPAR、GABAAR后对该作用无显著影响。5.中间神经元在Aβ_1-42流作用下,对应各钳制电流,其细胞兴奋性被显著抑制。随Aβ_1-42浓度增加,中间神经元单位时间内爆发的APs愈少。MLA可减弱Aβ_1-42对中间神经元兴奋性的抑制作用。AP5、DNQX、bicuculline分别拮抗NMDAR、AMPAR、GABAAR后对该作用无显著影响。6.低浓度Aβ_1-42灌流作用,在记录的各时间点均表现出明显的使锥体神经元兴奋性增强而使中间神经元兴奋性减弱的作用。7.Aβ_1-42的慢性作用可降低锥体神经元的阈电位,使其阈电位与静息电位之间的差值减小,细胞更易兴奋;而对中间神经元,Aβ_1-42使其静息电位、阈电位均降低,但静息电位的降低更为显著,神经元超极化,中间神经元静息电位和阈电位间电位差增高,细胞兴奋性减弱。8.1nM Aβ_1-42慢性灌流后抑制大鼠海马CA1区锥体神经元和中间神经元上100 mM choline诱导α7-nAChR产生的内向电流;O.lmM choline灌流作用后锥体神经元和中间神经元兴奋性明显增强,而1nM Aβ_1-42慢性灌流可抑制choline诱发的锥体神经元和中间神经元兴奋性增强作用;choline激动α7-nAChR可减弱Aβ_1-42对锥体神经元兴奋性增强及抑制中间神经元兴奋性的作用。结论1.Aβ_1-42增强海马CA1区锥体神经元的兴奋性而抑制中间神经元的兴奋性,提示Aβ_1-42促使CA1区神经元网络功能的紊乱、产生神经兴奋毒性作用。2.Aβ_1-42至少部分通过激动α7-nAChR发挥神经兴奋毒性作用。3.Aβ-42与胆碱对α7-nAChR具有交互抑制作用,因此提示增强体内胆碱能神经递质对α7-nAChR的激动作用会减弱Aβ_1-42对神经元的兴奋毒性作用,这为治疗AD提供了潜在的新靶点和新线索。