香菇多糖是从香菇子实体中提取的一种药用多糖，具有免疫调节、抗肿瘤、抗感染和抗病毒等活性，且毒副作用小。香菇多糖于1985年在日本批准上市为抗癌新药，在临床上辅助治疗肿瘤。但其结构复杂、抗肿瘤机制不明确，限制了香菇多糖的进一步开发和临床使用。　　目前对香菇多糖的抗癌免疫活性机制研究较多。多数研究者认为香菇多糖无直接的细胞毒作用,主要通过免疫途径发挥抗肿瘤作用，例如增强诱导杀伤T细胞、NK细胞和抗体依赖性巨噬细胞活性等。　　然而，近几年研究发现，植物多糖除了能提高宿主免疫功能间接抑制或杀灭肿瘤细胞外，还能通过诱导肿瘤细胞分化或凋亡、影响癌基因表达等途径发挥直接抗肿瘤作用。因此，深入研究香菇多糖抗肿瘤活性，阐明其直接抗肿瘤作用和机制变得十分重要。　　本论文采用水提醇沉、H2O2脱色和超滤技术得到香菇多糖，并检测其分子量和糖含量。体外实验研究香菇多糖对人乳腺癌细胞株MCF-7增殖抑制作用和诱导凋亡作用，并探讨其分子作用机制。建立MCF-7裸鼠移植瘤模型，研究香菇多糖的治疗作用，并初步探索分子机制。为阐明香菇多糖直接抗肿瘤作用机制作出贡献，也为增加香菇多糖临床使用范围提供实验和理论基础。　　第一部分、香菇多糖制备　　以湖北房县香菇子实体为原料，采用水提醇沉方法提取香菇粗多糖，并经H2O2脱色、超滤、冷冻干燥得香菇多糖。苯酚-硫酸法检测其糖含量约为98％；高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）测定其相对分子质量为6.23×105Da，且分子量均一；紫外扫描显示香菇多糖几乎不含核酸和蛋白质。以上结果显示，本方法制备的香菇多糖性状良好，纯度满足后续实验要求。　　第二部分、香菇多糖体外对人乳腺癌MCF-7细胞增殖抑制作用及机制研究　　采用MTT比色法考察香菇多糖对人乳腺癌细胞株MCF-7增殖抑制作用。结果表明，香菇多糖对肿瘤细胞的增殖有抑制作用，且呈剂量依赖性。流式细胞仪检测凋亡细胞，发现低（250μg/mL）、中（500μg/mL）、高（1000μg/mL）剂量组诱导肿瘤细胞凋亡呈明显的剂量依赖性，各剂量组细胞凋亡率分别为（4.69±1.43）%、（6.90±0.92）%、（9.97±0.75）%。实验结果表明，香菇多糖对肿瘤的抑制作用可能是通过诱导肿瘤细胞凋亡实现。　　为探究香菇多糖诱导MCF-7细胞凋亡的具体分子机制，采用蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测MCF-7细胞凋亡信号转导通路中关键蛋白Bcl-2、Bax、Cytochrome c、Caspase-7的表达。Western blot结果显示，Bax表达水平随着多糖浓度增加而升高；Bcl-2表达水平随着多糖浓度增加而降低。香菇多糖各剂量组Bax/Bcl-2值皆比阴性组大，且中、高剂量组差异有统计学意义。细胞中Cytochrome c的表达量随着香菇多糖浓度升高而增加。Cleaved Caspase-7表达水平结果显示，中、高剂量组香菇多糖能促进Caspase-7活化，而低剂量组香菇多糖对Caspase-7影响小。综上，香菇多糖作用于MCF-7细胞后，通过上调Bax表达水平，下调Bcl-2表达水平，引起线粒体膜通透性改变，Cytochrome c从线粒体内释放到胞浆。最终引起Caspase-7活化，诱导细胞发生凋亡。　　第三部分香菇多糖体内抑制MCF-7细胞裸鼠移植瘤生长作用及机制研究　　建立人乳腺癌MCF-7细胞裸鼠移植瘤模型，考察香菇多糖对MCF-7裸鼠移植模型肿瘤生长的抑制作用及其分子机制。裸鼠皮下注射MCF-7细胞，建立荷瘤裸鼠模型，并随机分为4组，阴性对照组（尾静脉注射等体积生理盐水，qd×21），香菇多糖低、中、高剂量组（分别尾静脉注射香菇多糖5mg/kg，10mg/kg，20mg/kg，qd×21）。实验过程中观察裸鼠状态，记录体重、肿瘤体积。实验结束后称量脾脏和肿瘤重量，计算抑瘤率，以此评价香菇多糖的抗肿瘤效果。对 MCF-7肿瘤组织进行 HE染色、TUNEL染色，观察凋亡细胞形态学变化。实验结果显示，香菇多糖低、中、高剂量对MCF-7实体瘤的抑制率分别为26%，39%和46%，呈剂量依赖性。香菇多糖组脾脏重量与对照组相比差异小，无统计学差异。由于裸鼠免疫功能缺失，香菇多糖免疫调节活性受限。由以上结果可推测香菇多糖可能通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥直接抗肿瘤作用。　　为探究香菇多糖诱导MCF-7细胞凋亡的具体分子机制，采用蛋白质免疫印迹法（western blot）检测MCF-7肿瘤组织中细胞凋亡信号转导通路中关键蛋白Bcl-2、Bax、Cytochrome c、Caspase-7的表达。结果显示，与阴性组相比，香菇多糖剂量依赖性降低抗凋亡蛋白Bcl-2表达量；升高促凋亡蛋白Bax表达量。且中、高剂量能显著增加Bax/Bcl-2值，低剂量组Bax/Bcl-2值增加不明显。低、中、高剂量组Cytochrome c的表达量分别增加了9%，35%和145%，且都有统计学差异。低、中、高剂量组cleaved Caspase-7的表达量分别增加了23%，88%和105%。但由于个体差异大，与阴性组相比，无统计学差异。综上，荷瘤小鼠尾静脉注射香菇多糖后，会触发肿瘤组织中线粒体参与的细胞凋亡信号转导通路，最终诱导肿瘤细胞发生凋亡。　　结合体外与体内实验，初步得出香菇多糖诱导肿瘤细胞凋亡分子机制。线粒体参与的凋亡主要途径为：促进Bax蛋白表达，同时抑制Bcl-2表达，促使Cytochrome c从线粒体释放，激活Caspase级联反应，活化Caspase-7，引起肿瘤细胞的凋亡，机制图如下。