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HIV-1融合抑制剂在病毒感染细胞初期发挥作用,由于作用靶点位于病毒表面,无需进入细胞,在抗HIV-1药物研究中备受关注。除了肽类HIV-1融合抑制剂,近年来,人们陆续发现一些基于核酸螺旋结构的分子,可作用于病毒表面包膜蛋白,具有HIV-1融合抑制活性。已报道的分子在结构上包括DNA双螺旋、三螺旋、四螺旋、以及多价复合结构。这些分子为抗HIV-1药物研发提供了先导结构,在已报道的研究中,抗HIV-1融合抑制活性大多在几百nM甚至几μΜ水平,设计具有新结构、高活性的抑制剂是核酸螺旋类HIV-1融合抑制剂的发展方向。本研究以经典的Hotoda四螺旋抑制剂为先导分子,以提高活性为目标,进一步从分子整体构型和空间组合等角度,进行三种新结构类型的分子设计,共包括:1.带有柔性末端的G四螺旋类结构;2.可交联的柔性末端四螺旋类结构;3.四螺旋末端缀合二肽MT钩子结构。1.带有柔性末端的G四螺旋类结构以Hotoda发现的G四螺旋为先导结构,大量的工作对芳香基团的种类和引入位点进行了各种探讨。在研究中,人们发现,这类分子的作用靶点与病毒表面包膜蛋白gp120和gp41相关。我们以Hotoda四螺旋为先导分子设计了一类带有柔性末端的G四螺旋结构,主要基于两点:1)gp120的V3 loop参与了与核酸螺旋抑制剂的相互作用,V3 loop带有正电荷,核酸带有负电荷,在G四螺旋末端增加柔性片段后,通过增加分子的电负性而增强其与V3 loop的电荷相互作用,提高分子与靶标之间亲和力;2)gp41的N末端重复序列（N-terminal heptad repeats,NHR）三聚体疏水沟槽较浅,G四螺旋分子的刚性结构不可能采取完全契合并深入到口袋内部的构象,刚性结构所能发挥的空间占位效应有限,在G四螺旋末端增加柔性片段后,有可能增强抑制剂作用于疏水沟槽时的占位效应,从而增强对膜融合过程中关键结构即6股螺旋（6-helix bundle,6HB）形成的抑制能力。本部分工作,设计合成了多个带有不同长度柔性末端的G四螺旋分子。通过细胞-细胞融合实验证明,柔性末端的设计确实有效提高了活性,其中,一个优选分子IC50值较经典的Hotoda四螺旋先导分子提高了10倍。采用了多个结构分析实验共同表征其结构,提示柔性末端没有显著影响其G四螺旋序列部分的分子间组装。通过表面等离子共振实验证明带有柔性末端的G四螺旋分子与靶蛋白gp120、gp41的相互作用较先导分子更强,通过抑制6HB形成实验证明带有柔性末端的G四螺旋分子较先导分子增强了对6股螺旋形成的抑制。与天然序列相比,新结构分子也显示出良好的代谢稳定性。2.可交联的柔性末端四螺旋类结构G四螺旋抑制剂的作用靶点gp120和gp41在空间分布上具有三个特征:1)gp120和gp41之间存在非共价相互作用,呈聚集状态。2)同一病毒表面同时存在多个包膜蛋白。3)gp41的NHR三聚体疏水口袋在空间上呈对称分布。基于前一部分设计的柔性末端四螺旋结构,我们进一步设计可交联的柔性末端四螺旋结构:在分子的柔性端增加可交联片段,即,在一条核酸序列上设计活性四螺旋组装区、连接区和交联区三个区域。活性四螺旋组装区序列组成为DMT-TGGGAG,可以在四条相同链间形成活性四螺旋结构;交联区序列设计成回文结构,可通过两条相同序列间反平行互补配对形成双螺旋结构,从而实现多个活性G四螺旋分子的交联。本部分工作,通过非变性凝胶电泳证明了交联结构的形成,但是在细胞-细胞融合实验中活性与相同长度的不能交联的柔性末端四螺旋对照组相当,这一结果可能是由于双螺旋序列部分的组装竞争性干扰了活性四螺旋序列部分的组装,降低了形成活性四螺旋的有效比例所致,也可能是由于这种交联的结构在空间上未能有效匹配靶点的空间结构所致。在后续工作中,我们将会对序列进行优化,以期获得高活性的交联结构。3.四螺旋末端缀合二肽MT钩子结构据报道,甲硫氨酸酰-苏氨酸酰（MT）二肽片段可以将C肽类融合抑制剂“锚定”在NHR疏水口袋区,增强对形成内源性6HB的抑制,被称为MT钩子结构。而G四螺旋抑制剂同样可以作用于HIV-1 gp41的NHR疏水口袋区,并抑制6HB的形成。在核酸螺旋抑制剂结构中缀合二肽MT钩子,或许能够进一步增强与结合区的空间契合度,发挥MT与靶标的“锚定”即氢键相互作用,提高核酸抑制剂与靶相互作用能力,增强抑制活性。在本部分工作中,通过氨基己醇连接臂将二肽MT钩子缀合在核酸序列磷酸骨架的5’末端。细胞-细胞融合实验显示,缀合二肽MT钩子的活性四螺旋分子相比没有MT钩子的四螺旋分子活性提高约3倍。通过非变性凝胶电泳、圆二色谱等实验,证明了缀合MT钩子不影响G四螺旋结构的形成。通过抑制6股螺旋形成实验证明缀合MT钩子的分子可以抑制内源性6HB的形成。本研究从分子构型和空间组合的思路进行理性设计,发现全新的先导结构,丰富了抗HIV-1核酸螺旋类抑制剂先导分子的种类。本研究设计的新核酸结构,也可为研究核酸高级结构和组装规律提供有价值的参考。