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人表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是一种受体酪氨酸激酶,与许多类型的人类癌症的发展有关。目前已知,EGFR常常会发生基因扩增、激酶结构域激活突变或EGFR(EGFR vIII)胞外结构域的片段缺失等遗传改变,促进其异常激活。第一代EGFR小分子酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors,TKI)是ATP竞争性可逆抑制剂,通过与ATP结合位点结合来阻断EGFR诱导的下游信号传导的激活。EGFR的致癌突变占非小细胞肺癌(NSCLC)人群的10-30%,全球每年诊断出大约10-20万NSCLC病例,其中两个频繁且相互排斥的原发突变是EGFR L858R和EGFR[d746-750](氨基酸746和750之间的外显子19缺失),占所有EGFR突变NSCLC病例的约85%。第一代EGFR激酶抑制剂Geftinib(ZD1839)和Erlotinib(OSI-774)对这类突变具有良好的反应率,然而用药9-11个月左右患者常常会产生耐药,其中大约60%由外显子20的T790M点突变驱动,这种突变恢复了组成型EGFR依赖性信号传导。本研究通过对第一代EGFR抑制剂结构改造,经过化合物初步筛选,发现了2个活性较好的化合物WS-157和YS-67,并在分子、细胞和动物水平进行了评价。第一部分:EGFR抑制剂WS-157抗肿瘤作用研究WS-157是我们筛选出的新的EGFR抑制剂,是在Geftinib结构基础上改造的新的喹唑啉衍生物。WS-157对EGFR wt(IC50=0.81nM)、EGFR[d746-750](IC50=1.2 nM)和EGFR L858R(IC50=1.1 nM)表现出很强的抑制活性,其效果优于Gefitinib。在EGFR wt细胞中,Western Blot检测结果显示WS-157可显著地抑制EGF诱导的p-EGFR和p-AKT,并呈剂量依赖性,其中1μM的WS-157或Gefitinib几乎完全阻止EGF刺激的p-EGFR和p-AKT的水平。然而在EGFR T790M/L858R突变的H1975细胞系中,WS-157和Gefitinib不能阻止该细胞p-EGFR和p-AKT的水平,这进一步证实WS-157对EGFR wt或敏感突变型EGFR[d746-750]和EGFR L858R较强的抑制性。在撤除化合物WS-157后,p-EGFR和p-AKT逐渐恢复,表明WS-157不仅是一种EGFR选择性抑制剂,而且是一种可逆性抑制剂。采用SRB法检测WS-157对不同组织来源的肿瘤细胞株的增殖抑制作用,结果显示WS-157对所有肿瘤细胞具有优异的抗增殖活性,并且活性与Gefitinib相似。细胞周期检测结果显示,WS-157在EGFR WT高表达的A549细胞株会引起细胞G1期的阻滞。同时,WS-157具有降低的集落形成和伤口愈合能力。在A431的裸鼠移植瘤模型中,WS-157(10 mg/kg/d)显示出良好的的抗肿瘤活性,并且157(40mg/kg/d)组裸鼠的肿瘤负荷几乎完全被157(40mg/kg/d)抑制。以上结果表明,我们发现的WS-157是一种EGFR可逆性和选择性抑制剂,不仅在细胞水平显著抑制EGFR及其下游信号通路的活化,而且在动物水平明显抑制肿瘤生长。第二部分:EGFR抑制剂YS-67抗肿瘤作用研究经过化合物初步筛选,我们得到了一种新的合成喹唑啉衍生物YS-67。YS-67对EGFR wt、EGFR[d746-750]和EGFR L858R均表现出优异的抑制活性(IC50=1~10nM),这与阳性药Gefitinib抑制活性相当。在EGFR WT高表达的A431细胞和A549细胞中,Western Blot检测发现,YS-67在1μM浓度下能够明显的抑制EGF诱导的EGFR的磷酸化,抑制效果稍弱于Gefitinib;在EGFR T790M/L858R突变细胞系H1975中,发现该化合物和Gefitinib类似,均不能阻止p-EGFR和p-AKT,这表明157是EGFR wt、敏感突变型EGFR[d746-750]和EGFR L858R抑制剂。在撤除化合物YS-67后,p-EGFR和p-AKT逐渐恢复,因此,表明YS-67不仅是一种EGFR选择性抑制剂,而且是一种可逆性抑制剂。进一步采用SRB法检测发现YS-67对不同组织来源的肿瘤细胞具有优异的抗增殖活性,并且显著强于Gefitinib。同时检测到YS-67能够显著抑制细胞克隆形成和划痕损伤修复能力。在EGFR WT高表达的A431的裸鼠异移移植瘤模型中,YS-67(40mg/kg/d)组对肿瘤的生长有明显的抑制作用,但抑制活性稍弱于阳性对照化合物Gefitinib,这提示YS-67可能还存在其他作用靶点,这有待于进一步研究。以上结果表明,本研究发现的YS-67是一种EGFR选择性和可逆性抑制剂,但其作用靶点和抗肿瘤机制尚需进一步研究。结论:我们的研究发现了对EGFR具有较强抑制活性的化合物WS-157和YS-67。WS-157通过抑制EGFR激酶的活性,阻断其下游信号转导通路,进而抑制肿瘤细胞增殖,产生抗肿瘤作用。在体内,WS-157(40mg/ml)几乎能完全抑制EGFR WT过表达细胞A431诱导的裸小鼠移植瘤的生长,表明了其显著的体内抗肿瘤活性。YS-67也是一种EGFR激酶抑制剂,能够在体外抑制EGFR及下游分子AKT磷酸化水平,并且在体内也具有抗肿瘤活性。然而,YS-67对EGFR激酶抑制活性不及Gefitinib,但对不同组织来源的肿瘤细胞的抗增殖活性强于Gefitinib,表明YS-67还存在其他靶点,这有待于进一步研究。