自然选择导致生物适应性进化被看作是自然界产生生物多样性的重要模式。目前,适应性进化机制依然是进化生物学的中心问题。青藏高原被称为“第三极”,有着强烈的紫外辐射、低温、盐碱化、低氧等多样的极端环境,同时也是世界生物多样性的热点地区之一,是探究极端环境中生物适应性进化的天然实验室。冰川棘豆(Oxytropis glacialis)是青藏高原的特有物种,能在青藏高原多重环境胁迫条件下广泛分布,具有很强的抗逆性,同时,因其全草有毒,被认为是危害草原畜牧业最为严重的毒草。本研究利用青藏高原不同生境条件下6个居群(羊八井YBJ、措勤CQ、扎布耶ZBY、萨普SP、双湖SH、珠峰ZF)共17个冰川棘豆的样本进行转录组测序,结合居群的环境检测和生物信息学分析,探讨青藏高原冰川棘豆适应高原极端环境的分子机制。本研究得到以下结论:(1)RNA-seq结果表明,6个居群共17个冰川棘豆RNA样本,测序共得到9,569,217,88条raw reads,质控后得到9,509,381,26条clean reads,Q20(%)均大于98%,优化组装得到3,017,38个unigenes,组装过滤后的clean reads为5,403,084,00条,其中有3,389,857,38条比对到组装转录本上,比对率为62.7%。unigenes GO注释表明,大部分unigenes被注释到细胞过程、代谢过程、细胞、细胞部分、结合以及催化活性;unigenes GO富集结果显示,富集程度较大的有细胞形状的调节、高尔基囊泡介导的转运、色素的生物合成过程、脱落酸激活信号通路、肽基丝氨酸磷酸化和肽基丝氨酸修饰等。unigenes KEGG注释表明,在所有代谢途径中,大部分unigenes被注释到碳水化合物代谢、氨基酸代谢、能量代谢、脂代谢、翻译、信号转导、运输分解代谢以及环境适应的代谢途径;unigenes KEGG富集表明,大部分unigenes被注释到光合作用、类胡萝卜素的生物合成、植物MAPK信号通路、植物激素信号转导以及植物与病原菌互作等相关通路。本研究冰川棘豆转录组学分析显示,与细胞形状调节、色素生物合成过程、脱落酸激活信号通路、植物MAPK信号通路、植物激素信号转导、光合作用和类胡萝卜素生物合成等相关的基因显著富集,这与已有的研究比较,初步揭示了冰川棘豆可能通过激活多重信号,响应刺激,通过信号转导,调节相关基因的表达,调控相关产物的代谢,继而调节细胞过程、代谢过程等,从而适应青藏高原极端环境,保证冰川棘豆正常的生命活动。这些功能基因可能有利于冰川棘豆适应青藏高原强辐射、低温以及盐胁迫等极端环境,也为进一步探讨其适应性的分子机制和毒草防控提供了基础。(2)不同海拔梯度下冰川棘豆RNA-seq数据结合加权基因共表达网络分析(weighted gene coexpression network analysis,WGCNA)显示,与海拔相关性最大的为黄色模块MEyellow(cor=0.662,p=0.00397),该模块GO富集分析表明,大多数基因富集在氨基化合物的生物合成过程、翻译、多肽的生物合成过程、多肽的代谢过程、DNA修复、细胞内氨基化合物的代谢过程、DNA代谢过程、DNA整合、脂质代谢过程、含核碱基化合物的代谢过程、杂环代谢过程、核酸代谢过程、有机环状化合物代谢过程、细胞内大分子代谢过程、含氮化合物的代谢过程、大分子代谢过程、细胞内含氮化合物的代谢过程、细胞内芳香化合物的代谢过程、生物过程和代谢过程。本研究注释到与DNA修复、DNA代谢、DNA整合相关的基因有:BRCA2、DMAP1、G6PD1、SCC1、ERCC2、INOC1、SMC6A、STIL3、IRAK4、CAPG、TOP2、DICER1、MYBP、CAPG、RGP1、CNBP、STR9、GIS2、CYP716A、IRAK4、POLX、XYL1、TF21,表明冰川棘豆可能在高原强辐射环境下细胞容易受到损伤,使得DNA修复、DNA代谢、DNA整合相关的基因比较富集,有利于冰川棘豆在高原强辐射环境下生存。与已有的研究比较,基础代谢相关基因的富集,表明冰川棘豆在基础代谢方面的表达比较活跃,活跃的新陈代谢可能有利于冰川棘豆对高原环境的适应。高海拔环境下辐射强度大,辐射强度随着海拔的升高而增强,强辐射对光合作用的影响最大。WGCNA分析得到与海拔相关性最大的黄色模块MEyellow,进行KEGG注释,得到10个与光合作用相关的基因psaA、psaH、psaN、psaO、psbA、psbE、psbP、psbQ、petC、petF,这些基因在海拔最高的ZF居群的表达量最低,在其他五个居群的表达量与海拔呈正相关;unigenes KEGG注释到5个与光保护物质类黄酮合成相关的基因HCT、CYP73A、CCOAMT、CA4H、C4H,这些基因在海拔最高的ZF居群表达量最低,在其他五个居群的表达量随着海拔的升高而升高。青藏高原不仅辐射强,而且常年低温,温度和海拔呈负相关。对黄色模块MEyellow的基因进行注释得到了BSK、RPL＿21、KC-S、I RAK4、CRPM2、TGS1、SRC2和cold-acclimation specific protein 15共8个与低温响应相关的基因,海拔较高的ZF、SH和SP居群相关基因的表达量高于海拔较低的ZBY、CQ和YBJ居群的表达量。(3)土壤电导率可以反应土壤盐浓度的高低。一般情况下,土壤的电导率大于0.2 ms/cm为盐生环境。本研究采样点的土壤电导率测定结果显示,ZBY的电导率为0.3 ms/cm,所以ZBY为盐生环境,YBJ为0.14 ms/cm、ZF为0.13 ms/cm、CQ为0.09 ms/cm、SH为0.05 ms/cm、SP为0.01 ms/cm,都是非盐生环境。利用RNA-seq数据结合WGCNA得出,与土壤电导率相关性最大的为紫色模块MEpurp le(cor=0.589,p=0.00797),并筛选出23个与盐胁迫相关的基因,根据这些基因编码的产物,可以将这些基因分为以下四类。第一,编码抗氧化酶类相关的基因:CCPR、pepN、NDUFS4、msrA、mtn-D、gpx、trxA、SOD2、PTA14、PRDX5;第二,渗透调节物质相关的基因:R FS、ACLY、metK、metE;第三,激素水平调节盐胁迫相关的基因:SAUR、AX10A;第四,其它调节盐胁迫相关的基因:HRR25、PSM B7、MYO1、ATPeV1D、RAB1A、RAN、EEF1A。这些与盐胁迫相关的基因在盐生环境ZBY居群中高表达,表明盐胁迫条件下冰川棘豆可以通过提高盐胁迫相关基因的表达量来适应盐生环境。(4)unigenes KEGG注释到冰川棘豆与病原菌相互作用的代谢通路。冰川棘豆在受到病原体侵染时会通过信号刺激,激活相应的基因对上游信号刺激做出反应,调控下游基因和转录因子RAR1、SGT1、HSP90、WRKY25、WRKY29、WRKY1、NHO1、PR1的表达,其中RAR1、SGT1和HSP90的表达会导致超敏反应;WRKY1诱导防御相关基因的表达和细胞的程序性死亡;WRKY25和WRKY29的表达会导致防御相关基因NHO1和PR1的表达,使得植物抗毒素积累和miRNA的产生,从而保证冰川棘豆正常的生命活动。