和转移等某些恶性疾病的病理特征,其病理改变以及临床表现上都与肿瘤疾病有着相似之处。这些研究结果提示我们可以从研究肿瘤细胞的生物学角度去观察子宫内膜异位症在位内膜细胞功能的变化情况,并以此为研究方向来探讨其分子病理的情况。本研究拟首先观察AnnexinⅠ在临床EMS病人中的表达情况,同时参照文献报道的方法在体外分离和培养人子宫内膜腺上皮细胞,在这些工作的基础上采用体外实验进一步探讨AnnexinⅠ在子宫内膜异位症中的具体作用机制。方法一、临床资料的收集及观察AnnexinⅠ的表达情况1选择2005年6月至2006年6月,因子宫内膜异位症在中国医科大学盛京医院妇产科经开腹手术或腹腔镜手术行子宫切除术的病例组织,选择同期因宫颈病变CINⅢ行子宫切除的患者的子宫内膜组织为对照(对照组)2免疫组织化学方法检测AnnexinⅠ在子宫内膜异位症组织中的表达情况3免疫荧光化学方法检测AnnexinⅠ在子宫内膜异位症组织中的表达情况。4实时定量PCR(Real-time PCR)方法检测AnnexinⅠ在子宫内膜异位症组织中的表达情况。5 western blot方法检测AnnexinⅠ在子宫内膜异位症组织中的表达情况。二、体外分离及培养人子宫内膜细胞1收集标本2用胶原酶消化,筛网滤过的方法分离培养人子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞。3倒置光学显微镜下观察细胞的形态、贴壁状态。4利用免疫细胞化学方法鉴定培养细胞的纯度。5利用免疫荧光技术鉴定培养细胞的纯度。6利用免疫细胞化学方法检测AnnexinⅠ的表达情况。7三重免疫荧光的方法检测AnnexinⅠ在子宫内膜腺上皮细胞中的分布情况。三、AnnexinⅠ在子宫内膜异位症中的作用机制1收集临床新鲜子宫内膜标本。2用含有EGF的培养液培养正常人子宫内膜腺上皮细胞及内异症在位内膜腺上皮细胞。3倒置光学显微镜下观察细胞的形态、贴壁状态。4细胞粘附试验观察细胞在底物上的粘附能力。5 western blot方法检测EGF作用后两种内膜腺上皮细胞中细胞粘附分子α4β1 integrin和AnnexinⅠ的表达情况。6三重免疫荧光技术检测AnnexinⅠ与细胞粘附分子α4β1 integrin在正常内膜腺上皮细胞中的共分布情况。7免疫共沉淀方法检测AnnexinⅠ与细胞粘附分子α4β1 integrin在正常内膜腺上皮细胞中相互作用情况。8免疫共沉淀方法检测EGF作用后两种内膜腺上皮细胞中AnnexinⅠ与细胞粘附分子α4β1 integrin相互作用情况。9免疫沉淀方法检测EGF作用后异位症内膜腺上皮细胞中AnnexinⅠ酪氨酸磷酸化水平。结果1收集因子宫内膜异位症经开腹手术或腹腔镜手术行子宫切除术的患者35例,选择同期因宫颈病变CINⅢ行子宫切除的10例患者的子宫内膜组织为对照(对照组)2 Real-time PCR结果显示内异症在位内膜组织中AnnexinⅠmRNA表达水平(0.0045±0.0019)低于正常内膜组织(0.014±0.005)2.1倍,二者比较有统计学差异(t=2.35,P＜0.05)。Western blot结果显示内异症在位内膜组织蛋白水平(0.44±0.16)低于正常内膜组织(0.15±0.04)1.9倍。二者比较有统计学差异(t=2.92,P＜0.05)。3免疫组化和免疫荧光结果显示AnnexinⅠ在正常内膜组织和内异症内膜组织中的分布一致,主要分布在子宫内膜腺体区腺细胞膜的周围,免疫组化的结果进行定量分析发现AnnexinⅠ在内异症在位内膜组织表达水平(10.34±0.76)低于正常内膜组织(20.47±1.9)(t=5.95,P＜0.05)。4在体外成功分离和培养了人子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞,经免疫细胞化学和免疫荧光染色技术鉴定细胞纯度可达95%。5免疫细胞化学结果显示AnnexinⅠ主要分布在正常子宫内膜腺细胞的细胞膜周,并且在内异症的在位内膜腺细胞中表达明显减少。双重免疫荧光结果表明AnnexinⅠ与腺上皮细胞标志分子cytokeratin共同分布在细胞膜的周围。6加入EGF后异位症的在位内膜腺上皮细胞的粘附力较正常的内膜腺上皮细胞明显升高7 EGF处理前后,在正常子宫内膜腺上皮和异位症内膜腺上皮中,α4β1integrin的表达没有明显的改变,AnnexinⅠ的表达不仅在异位内膜腺上皮中表达下降,而且EGF可以使腺上皮中AnnexinⅠ的表达水平下降。8在正常的子宫内膜腺上皮细胞中AnnexinⅠ与细胞粘附分子α4β1 integrin相互作用可能介导细胞的生物功能。9 EGF不影响正常的子宫内膜腺细胞中与AnnexinⅠ结合的α4β1 integrin的数量,而在异位内膜的腺上皮细胞中与AnnexinⅠ结合的α4β1 integrin的数量明显减少,而且在EGF处理后的异位内膜腺细胞中,与AnnexinⅠ结合的α4β1 integrin较EGF作用前减少。10 EGF可以明显增加内异症在位内膜腺上皮细胞中AnnexinⅠ的磷酸化水平。结论1在临床资料中发现AnnexinⅠ在子宫内膜异位症在位内膜组织中表达水平下降,印证了子宫内膜异位症的“源头学说——在位内膜决定论”。2通过改良的方法,在体外成功的分离和培养了人子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞,建立了研究子宫内膜异位症的体外研究模型。3观察到AnnexinⅠ在子宫内膜异位症在位内膜组织腺上皮细胞中表达下调,并且这种下调可能通过影响与之在细胞膜上相互作用的粘附分子α4β1 integrin的功能而间接促进了内膜组织的异位种植过程。