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目的:miRNA是一类高度保守的内源性非编码单链小分子RNA,主要是与靶mRNA 3’UTR特异性结合,促进目标mRNA降解或抑制其蛋白翻译,进而对基因的表达发挥负向调控作用。近年来大量研究表明miRNA在不同的肿瘤中可作为癌基因或抑癌基因参与调节肿瘤细胞侵袭、转移等生物学行为[1]。研究认为miR-199a在多种肿瘤中组织和细胞中呈低表达,其中包括浸润性乳腺癌,而且miR-199a能通过MAPK信号通路促进肿瘤的发生、进展。ERK5,是MAPK家族成员中被发现最晚的蛋白激酶,并且能显著增强乳腺癌细胞迁移和侵袭能力。本实验瞬时转染miR-199a-5p mimic至MDA-MB-231细胞,采用Transwell侵袭实验、细胞免疫荧光和Western blot等方法就乳腺癌中miR-199a-5p和ERK5的关系以及miR-199a-5p抑制乳腺癌细胞侵袭的分子机制进行探讨,为以miR-199a-5p作为标记物对乳腺癌的靶向治疗提供依据。方法:(1)培养MDA-MB-231细胞,细胞密度达80%左右,采用Lipofectamine2000的方法,瞬时转染miR-199a-5p mimic到细胞中,miR-199a-5p mock作为对照。并用地高辛标记的短链siRNA转染至细胞中,检测外源性的RNA含量以判断转染效果。Transwell侵袭实验检测转染后miR-199a-5p mimic/MDA-MB-231和miR-199a-5p mock/MDA-MB-231细胞的侵袭能力。(2)细胞免疫荧光及Western blot方法检测miR-199a-5p mimic/MDA-MB-231和miR-199a-5p mock/MDA-MB-231细胞中E-cadherin、vimentin蛋白的表达。Western blot检测miR-199a-5p mimic/MDA-MB-231和miR-199a-5p mock/MDA-MB-231细胞中ERK5、pERK5、EGF和SP1的表达,并应用LNA-siRNA抑制miR-199a-5p后,Western blot方法检测miR-199a-5p LNA-siRNA、LNA-scramble siRNA细胞中ERK5、pERK5、EGF和SP1的表达。(3)应用生物信息学TFsearch软件,发现ERK5启动子上游﹣201/﹣207(GGGCGG)的区域含有SP1的结合位点。本研究采用染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,CHIP)方法检测ERK5与SP1之间的关系。结果:(1)地高辛标记的短链siRNA转染至细胞中4小时后,检测到细胞中存在大量外源性的RNA片段,并持续3天,转染成功。Transwell侵袭实验显示:MDA-MB-231细胞过表达miR-199a-5p后,miR-199a-5p mimic组细胞侵袭数目较少,miR-199a-5p mock组中细胞侵袭数目较多。(2)细胞免疫荧光和Western blot结果:与miR-199a-5p mock组相比,miR-199a-5p mimic组中E-cadherin在细胞膜表达明显增加,胞质中的vimentin表达下降明显,同时,Western blot检测结果也显示miR-199a-5p能显著增加E-cadherin的表达,降低vimentin蛋白的表达(P<0.05)。(3)Western blot结果:miR-199a-5p过表达后,与miR-199a-5p mock组相比,miR-199a-5p mimic能明显降低ERK5、pERK5、EGF、SP1的表达(P<0.05),应用LNA-siRNA沉默miR-199a-5p后(P<0.05),miR-199a-5p LNA-siRNA组中ERK5、pERK5、EGF、SP1的表达比LNA-scramble siRNA组中显著升高(P<0.05)。(4)染色质免疫共沉淀结果:加入SP1抗体的实验组中出现特异性DNA条带,而加入IgG抗体组则无相应条带显示。结论:(1)miR-199a-5p能调节EMT相关蛋白E-cadherin、vimentin的表达,并且抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的侵袭,为将其作为乳腺癌侵袭的靶向治疗提供参考依据。(2)miR-199a-5p能通过调节EGF、SP1下调ERK5的表达并抑制其磷酸化,从而对乳腺癌MDA-MB-231细胞的侵袭发挥抑制作用。