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目的:胶质瘤是中枢神经系统中最常见的侵袭性高、预后较差且死亡率高的恶性肿瘤。目前主要的治疗方法是手术结合术后放化疗。血肿瘤屏障(blood-tumor barrier,BTB)的存在很大程度上限制了大分子抗肿瘤药物进入脑肿瘤组织,严重影响了药物治疗效果。因此,如何选择性开放BTB对于提高脑胶质瘤的化疗疗效至关重要。RNA结合蛋白(RNA-binding protein,RBP)可以与非编码RNA结合,调控其表达和功能。RNA结合蛋白KHDRBS3(含KH RNA结合域的信号转导相关因子3),可以通过KH RNA结构域与RNAs结合,调节靶基因的选择性剪接。已有文献报道,与KHDRBS3同属于STAR家族的成员Quaking(QKI),不仅参与胚胎血管的形成和重建,而且还在转录后水平上调节VE-cadherin和β-catenin的表达,从而影响内皮屏障功能。目前KHDRBS3是否对BTB的功能有调控作用,尚未见报道。环状RNA(circular RNA,circRNA)是一种没有5’帽子和3’多聚(A)尾结构的非编码单链RNA分子。CircRNA具有广泛的生物学功能,例如与RBP相互作用并调节mRNA剪接和稳定性,miRNAs的分子海绵等。环状RNA DENND4C(c DENND4C,也称为hsa＿circ＿0005684)由DENND4C基因外显子3-10环化形成。研究证明cDENND4C在乳腺癌中高表达,缺氧12 h和24 h使内皮细胞中cDENND4C的表达明显增加。目前尚未见cDENND4C与BTB通透性的相关报道。微小RNA(micro RNA,miRNA)是一种非编码RNA,通常与mRNA的3’非翻译区(UTR)结合,并在转录后水平调控靶基因的表达。MiR-577在胶质母细胞瘤、肝细胞癌、结直肠癌等多种类型的肿瘤中表达下调。此外,miRNAs也参与血管功能的调节,例如miR-181-5p和miR-330-3p均参与调节BTB通透性。目前尚未证实miR-577对BTB的通透性是否具有调节作用。本研究首先明确KHDRBS3、cDENND4C和miR-577在人脑胶质瘤微血管内皮细胞中的表达水平,在此基础上研究三者之间的调控关系以及对BTB通透性的调节效果。通过证实选择性开放BTB的新靶点,能够为脑胶质瘤的化疗提供新策略。方法:建立体外血肿瘤屏障及血脑屏障模型,qRT-PCR检测KHDRBS3、cDENND4C和miR-577在与星形胶质细胞共培养的脑微血管内皮细胞(human brain microvascular endothelial cells cocultured with astrocytes,AECs)和与胶质瘤细胞共培养的脑微血管内皮细胞(human brain microvascular endothelial cells cocultured with glioma cells,GECs)中的表达水平。在GECs中转染KHDRBS3沉默载体、cDENND4C沉默或过表达载体以及agomir-577或antagomir-577后,qRT-PCR或Western blot检测转染效率。跨内皮电阻(TEER)和辣根过氧化物酶(HRP)渗透量测定评估BTB通透性,Western blot和免疫荧光检测紧密连接相关蛋白ZO-1,occludin和claudin-1表达水平及分布的变化。RNA免疫沉淀实验和RNA pull-down实验证实KHDRBS3与cDENND4C之间存在结合。双荧光素酶报告基因系统分析c DENND4C与miR-577、miR-577与ZO-1、occludin和claudin-1 mRNA的3’UTR存在结合并明确结合位点。流式细胞术分析单独或联合调控KHDRBS3、cDENND4C和miR-577的表达,对多柔比星(doxorubicin,DOX)诱导U87胶质瘤细胞凋亡率的影响。结果:与AECs组相比,KHDRBS3在GECs中高表达。沉默KHDRBS3的表达破坏了BTB的完整性,增加了其通透性,显著降低了紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-1的表达水平,减少了内皮细胞间紧密连接的线性分布。cDENND4C在GECs中高表达,lin-DENND4C在AECs和GECs中的表达未见差异。沉默cDENND4C的表达后BTB完整性破坏,通透性增加,伴有ZO-1、occludin和claudin-1的表达显著下调,内皮细胞间紧密连接的线性分布减少。KHDRBS3与cDENND4C之间存在结合。沉默GECs中KHDRBS3的表达后显著下调了cDENND4C的表达水平,缩短了cDENND4C的半衰期,而对新生cDENND4C的表达无影响。与KHDRBS3沉默组相比,同时沉默GECs中KHDRBS3和cDENND4C的表达显著增加了BTB通透性,下调了紧密连接相关蛋白的表达水平;在沉默GECs中KHDRBS3的基础上过表达cDENND4C则显著降低了BTB通透性,增加了紧密连接相关蛋白的表达水平。MiR-577在GECs中低表达,与ZO-1、occludin和claudin-1mRNA的3’UTR区存在结合。过表达GECs中的miR-577显著增加了BTB的通透性,下调了紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-1的表达和内皮细胞间的线性分布。MiR-577能够靶向结合cDENND4C。与cDENND4C沉默组相比,在沉默GECs中cDENND4C的基础上沉默miR-577的表达,显著降低了BTB通透性,增加了紧密连接相关蛋白的表达。与DOX单用组相比,KHDRBS3沉默、cDENND4C沉默或miR-577过表达联合应用DOX能显著增加U87胶质瘤细胞的凋亡率;与KHDRBS3或cDENND4C单独沉默联合应用DOX组相比,KHDRBS3和cDENND4C双沉默联合应用DOX显著增加了U87胶质瘤细胞的凋亡率;与cDENND4C沉默或miR-577过表达联合应用DOX组相比,cDENND4C沉默同时miR-577过表达联合应用DOX显著增加了U87胶质瘤细胞的凋亡率。结论:1、KHDRBS3和cDENND4C在GECs中高表达,沉默KHDRBS3或cDENND4C的表达能够破坏BTB完整性,增加其通透性。2、KHDRBS3通过结合cDENND4C并增加其稳定性,调节BTB的通透性。3、Mi R-577在GECs中低表达,过表达miR-577通过负性调控靶基因紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin、claudin-1的表达,增加BTB通透性。4、cDENND4C结合miR-577并抑制其对紧密连接相关蛋白的负性调控,影响BTB的通透性。5、单独或联合调控KHDRBS3、cDENND4C和miR-577的表达能够促进DOX通过BTB,诱导胶质瘤细胞凋亡。