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研究背景与目的溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种原因尚不明确的非特异性炎症性疾病,主要累及直肠及结肠。近10年来,该病在亚洲的发病率明显增加,其中我国溃疡性结肠炎的发病率已高达11.6/10万,成为我国消化系统常见疾病。UC的发病机制迄今为止仍未完全明了。目前认为是环境因素、遗传易感性、肠道菌群和宿主相互作用以及肠道免疫功能紊乱等多种因素作用的结果。UC的临床症状多样,可出现腹胀、腹痛、腹泻及血便,可以有乏力、纳差、体重下降等,其中黏液血便是其特征性表现。约三分之一的患者还可发生骨关节、胆管、皮肤、结膜等多部位的肠外表现。肠镜下可见黏膜红斑、血管纹理模糊紊乱、黏膜糜烂、充血、肿胀、变脆、颗粒感增强、出血及溃疡形成。由于病因尚不明确,缺少治愈性的药物及治疗手段,该病容易迁延不愈,远期预后不佳。目前常用的治疗方案是以氨基水杨酸制剂为主,还包含激素、免疫抑制剂以及生物制剂等药物的综合应用达到诱导和维持炎症缓解的临床疗效,降低因疾病所致失能以及结肠切除和结直肠癌的风险。以上治疗方法解决了许多临床问题,但药物副作用较大、患者不耐受及费用昂贵等问题仍然不容忽视,新的治疗方法亟待发现。近年来研究发现肠道微生态与UC等多种疾病的发生发展密切相关,UC患者肠道菌群丰度较正常人明显减少,菌群结构也发生明显改变。通过改变肠道微生态来治疗该疾病的努力获得了显著的成效。粪菌移植(Fecal Microbiota Transplantation,FMT)作为一种改变肠道菌群既古老又创新的技术,对90%以上的复发性艰难梭菌感染(Clostridium difficile infection, CDI)患者有效。另有大量研究发现FMT对UC也有一定的治疗价值,但作用机制仍未得到阐明。研究人员在UC发病早期便观察到结肠黏膜屏障功能受损和肠道菌群紊乱,提示肠黏膜屏障功能在UC的发病中十分重要。最近也有研究发现调节肠道菌群能不同程度改善肠黏膜屏障功能。这些重要发现为本课题的研究提供了思路和线索。为此我们建立了硫酸葡聚糖(dextran sulfate sodium,DSS)诱导的UC小鼠模型,并观察了 “粪菌移植”治疗对UC小鼠的作用以及对肠黏膜机械屏障的影响,为进一步阐明FMT治疗UC的作用及机制提供了一定的实验依据及治疗思路。方法1.实验分为对照组、模型组、FMT预防组和FMT治疗组:对照组饮纯净水14天,模型组7天DSS加7天纯净水,FMT预防组7天DSS+FMT后饮用7天纯净水,FMT治疗组7天DSS加7天FMT;2.制备FMT菌液,并对FMT预防组和FMT治疗组的UC模型小鼠进行灌胃处理;3.采用16S rRNA技术分析所用FMT菌液的菌群结构,对移植液FMT菌液进行质量控制;4.评估各组小鼠的疾病活动程度;5.小鼠粪便隐血试验;6.HE染色观察各组小鼠结肠病组织病理学改变情况;7.透射电镜观察各组小鼠结肠上皮的超微结构;8.免疫组织化学染色观察各组小鼠结肠上皮组织中紧密连接相关蛋白ZO-1和Occludin表达情况;9.检测各组小鼠血清D-乳酸含量;10.检测各组小鼠血清TNF-a含量;11.各组小鼠肠道菌群分析;12.应用Image J图形处理软件和SPSS 19.0统计学软件对数据进行分析处理。结果1. 一般情况改变模型组、FMT预防组和FMT治疗组小鼠经过DSS诱导后开始出现倦怠、毛色晦暗,大便变软等表现,并逐渐出稀便、肉眼血便以及直肠出血。停用DSS后FMT治疗组小鼠在经过FMT后一般情况恢复较模型组和FMT预防组明显更快。2.体质量变化情况DSS诱导UC小鼠建模成功后,除对照组外其余各组小鼠均出现了明显的体质量下降,FMT预防组和模型组在DSS诱导2天后便开始出现体质量持续性下降,并在第10天时降至最低点,FMT治疗组在第7天体质量降至最低点后未继续下降,随即逐渐缓慢恢复。在实验第14天时,FMT治疗组体质量较模型组和FMT预防组显著增高(P <0.05)。3.疾病活动程度变化DSS开始诱导后模型组、FMT预防组和FMT治疗组小鼠疾病活动评分不断增高,在实验第8天时达到最高,随后逐渐下降,在第14天时FMT治疗组小鼠疾病活动程度较FMT预防组和FMT治疗组明显减轻(P< 0.01 )。4.小鼠结肠大体观察经DSS诱导后模型组、FMT预防组和FMT治疗组小鼠结肠均出现肠管透明度变差、散在出血、部分肠管缩窄等,结肠长度明显缩短。FMT治疗组小鼠经过7天灌胃后结肠肉眼观察较模型组和FMT预防组结肠炎症情况改善,结肠长度更长(P<0.05),结肠表面未见明显出血。5.小鼠结肠组织学改变DSS诱导7天后,模型组、FMT预防组和FMT治疗组结肠组织均出现了炎症细胞浸润、溃疡形成、上皮细胞脱落等表现,经过7天FMT灌胃处理后FMT治疗组小鼠结肠上皮损伤恢复明显较FMT预防组和模型组自然恢复效果更好。6.结肠组织超微结构改变DSS诱导7天后,电镜观察到FMT预防组小鼠结肠上皮细胞形态、细胞间紧密连接明显好于模型组和FMT治疗组,经过7天FMT灌胃处理后,FMT治疗组小鼠结肠上皮细胞形态、细胞间紧连接较模型组和FMT预防组恢复更好。7.结肠上皮紧密连接相关蛋白ZO-1和Occludin的表达情况对照组结肠上皮组织ZO-1、Occludin在实验第7天和第14天时均有表达;DSS结肠炎小鼠模型组第7天时,结肠上皮组织ZO-1和Occludin表达与对照组相比均显著下降(P<0.01),在第14天时两者表达恢复至对照组水平;FMT预防组小鼠结肠上皮组织ZO-1和Occludin在第7天时与模型组相比,表达显著增加(P<0.01),第14天时,ZO-1和Occludin的表达与模型组无显著差异;FMT治疗组小鼠结肠上皮组织ZO-1和Occludin在第14天时,表达显著高于模型组(P<0.05)。8.小鼠血清D-乳酸含量变化DSS结肠炎模型组小鼠在第7天和第14天时血清D-乳酸水平均显著高于对照组(P<0.01)。FMT治疗组第14天时,血清D-乳酸水平虽高于对照组,但较模型组显著下降(P<0.01),提示经过FMT治疗后结肠黏膜屏障功能明显恢复。9.各组小鼠血清炎症因子TNF- a含量变化模型组小鼠在第7天和第14天时血清TNF- a水平均高于对照组(P < 0.01 ),FMT治疗组小鼠灌胃7d后(实验第14天)血清TNF-a水平虽高于对照组,但较模型组已明显降低(P< 0.01),炎症程度减轻。10.移植用FMT菌液质量控制分析发现每次移植用FMT菌液包含的细菌数量在同一数量级,在属水平上菌群结构基本一致,FMT菌液菌群组成结构稳定。11.各组小鼠肠道菌群分析模型组小鼠经过DSS诱导1周后粪便菌群结构与诱导前相比,乳杆菌属明显下降而拟杆菌属和颤螺旋菌属增加,停用DSS自然恢复1周后,乳杆菌属所占比例未明显恢复,但增高的拟杆菌属水平有所下降,而颤螺旋菌属持续增加。FMT预防组肠菌移植1周后,小鼠肠道菌群变化趋势与模型组类似,但在停用DSS自然恢复1周后,乳杆菌属及Allobaculum菌属较模型组所占比例明显增加,而拟杆菌属和颤螺旋菌属减少。FMT治疗组小鼠经粪菌移植过后,粪便菌群结构与模型组相比出现更明显的乳杆菌属增加而拟杆菌属和颤螺旋菌属减少,表现出向模型诱导前小鼠菌群结构的方向改变。结论1.模型组小鼠经过DSS诱导7天后出现明显的肠道菌群紊乱和肠黏膜屏障受损;2.在14天的实验周期内,FMT预防组小鼠的症状、结肠组织炎症和肠黏膜屏障恢复不明显,经过FMT移植后紊乱的肠道菌群也无明显改善,但停用DSS饮水恢复7天后,FMT预防组小鼠的肠道菌群明显优于模型组,提示预防组在DSS因素的存在下进行FMT可能有部分细菌以“种子菌”的形式定植在小鼠肠道内,并在停用DSS后迅速繁殖,发挥一定的作用;3. DSS模型组小鼠在经过FMT治疗以后,肠道菌群结构、结肠大体表现、组织学改变、炎症指标及肠黏膜屏障相关的紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达明显恢复,小鼠症状显著改善,提示FMT治疗DSS小鼠结肠炎的效果明显;4. FMT可能通过调节肠道菌群结构,减轻结肠炎症,促进小鼠结肠黏膜屏障功能的恢复,从而发挥治疗DSS小鼠结肠炎的作用。