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内皮细胞作为血管生成的重要环节,靶向维持其功能稳态,可有效促进心肌梗死区域侧枝循环的建立,改善心肌梗死(Myocardial infarction,MI)。1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate,S1P),鞘磷脂的重要代谢产物,作为一种内皮功能和内皮损伤反应的强力调节因子,以其为中心环节的信号轴,尤其是S1P-S1P受体(Sphingosine 1-phosphate receptoers,S1PRs)受体途径被认为是治疗血管内皮功能紊乱的理想靶点。但相对于S1P胞外功能的研究,胞内S1P对血管内皮功能的调节知之甚少。Spinster同系物2(Spinster homolog 2,SPNS2)作为S1P在内皮细胞的主要转运体,其介导的胞内外S1P含量变化及相关信号通路的改变是否以及如何参与了对内皮细胞功能调节及血管生成仍有待进一步研究。本研究证实SPNS2通过调节胞外S1PS1PR1/3,尤其是胞内鞘氨醇激酶2(Sphingosine kinase 2,SPHK2)信号调节人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)增殖、迁移和管腔样结构生成,并且该胞内途径依赖于线粒体内SPHK2介导的线粒体功能改变。第一部分心肌梗死大鼠侧枝循环形成及SPNS2表达目的:以心肌梗死模型SD大鼠为研究对象,观察心肌梗死后侧枝循环的形成及SPNS2的表达情况。方法:60只8周龄雄性SD大鼠随机分为对照组(n=15)、假手术组(n=20),死亡2只,和MI组(n=25),死亡5只,各组均给予普通饮食喂养。手术组行冠状动脉左前降支(left anterior descending,LAD)结扎术构建心肌梗死模型,假手术组开胸穿线未结扎。术后心电图监测可见明显的ST段弓背抬高,证实MI术结扎成功。MI术6周后对各组SD大鼠进行心电监测,并安乐死。分离心脏,TTC检测心肌梗死水平;苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosin staining,HE)观察心肌病理学改变,Masson染色观察心肌纤维化程度;蛋白免疫印迹(Western blot,WB)检测血管内皮标记物血小板-内皮细胞粘附分子(Platelet endothelial cell adhesion molecule-1,CD31)及SPNS2的表达,免疫荧光观察CD31与SPNS2的表达及共定位情况。结果:与正常组及假手术组相比,心电结果显示MI组ST段明显抬高,出现病理性Q波;TTC染色显示MI组梗死面积显著增加;HE染色表明MI组心肌坏死增加,坏死部位心肌纤维呈波浪状,肌浆凝聚,形成红染深浅不一的横带;Masson染色显示MI组胶原纤维明显增加、心肌纤维化程度增高;WB结果显示梗死区域CD31及SPNS2表达均显著增加,免疫荧光显示心肌梗死区域CD31与SPNS2存在共定位,并且心肌梗死区域血管内皮SPNS2荧光强度明显高于对照组及假手术组。小结:大鼠MI模型构建成功,MI区域侧枝循环及血管内皮细胞SPNS2表达均显著增加。第二部分沉默SPNS2非胞外S1P-S1PRs完全依赖性调节人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖、迁移和管腔样结构形成目的:观察SPNS2敲低对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖、迁移、及管腔样结构形成的影响,探讨SPNS2对血管生成的作用和潜在机制。方法:培养HUVEC,构建SPNS2短发夹RNA(short hairpin RNA,sh RNA)慢病毒颗粒,预实验明确慢病毒转染HUVEC的感染复数(Multiplicity of infection,MOI=50)。分别用慢病毒空载体、SPNS2sh RNA慢病毒转染HUVEC(16h),随后,利用嘌呤霉素(2.5ug/ml)处理48h构建空载体慢病毒及SPNS2 sh RNA慢病毒稳转细胞株,随后分别用PBS及S1P处理。分组如下:HUVEC+磷酸缓冲盐溶液(Phosphate buffer saline,PBS)、HUVEC+空载体慢病毒、HUVEC+SPNS2 sh RNA慢病毒、HUVEC+SPNS2 sh RNA慢病毒+S1P。免疫荧光检测稳转株构建、实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,RT-PCR)、WB检测SPNS2的表达水平,Ki67检测HUVEC增殖;Trans-well检测HUVEC迁移;小管形成实验检测管腔样结构形成能力,RT-PCR、WB检测S1PR1及S1PR3的表达。结果:与对照组及空载体慢病毒组相比,SPNS2 sh RNA慢病毒转染组SPNS2 m RNA及蛋白表达水平明显降低,HUVEC的增殖、迁移能力亦显著降低。并且,SPNS2 sh RNA显著抑制了HUVEC的管腔样结构的形成能力。进一步结果显示SPNS2 sh RNA下调了S1PR1及S1PR3的表达,而在SPNS2 sh RNA基础上外源性加入S1P恢复S1PR1及S1PR3表达后,SPNS2 sh RNA诱导的HUVEC功能损伤虽有所改善,但与对照组及空载体组相比仍有显著的统计学差异。小结:SPNS2 sh RNA显著抑制HUVEC增殖,迁移及管腔样结构形成,并进一步下调S1PR1及S1PR3的表达,但胞外S1P恢复S1PR1及S1PR3表达后,HUVEC功能并没有得到完全恢复。第三部分沉默SPNS2经下调胞内SPHK2调节HUVEC增殖、迁移和管腔样结构形成目的:研究SPNS2敲低是否通过调变HUVEC内1-磷酸鞘氨醇激酶-1(SPHK1)和1-磷酸鞘氨醇激酶-2(SPHK2)的水平及活性影响HUVEC功能与管腔样结构形成及可能机制方法:培养正常HUVEC,空载体稳转株,SPNS2 sh RNA慢病毒稳转株,实验分组如下:HUVEC+PBS,HUVEC+空载体慢病毒,HUVEC+SPNS2 sh RNA慢病毒,HUVEC+SPNS2 sh RNA慢病毒+SPHK2人源重组蛋白,HUVEC+SPNS2 sh RNA慢病毒+S1P。RTPCR检测SPHK1及SPHK2的m RNA表达,WB和免疫荧光检测两者的蛋白表达及磷酸化水平;Ki67检测HUVEC增殖;Trans-well检测HUVEC迁移;小管形成实验检测管腔样结构形成能力。结果:与对照及空载体慢病毒组相比,SPNS2 sh RNA显著降低SPHK2的m RNA及蛋白水平,P-SPHK2/SPHK2并无明显变化,但SPHK1 m RNA、蛋白表达及P-SPHK1/SPHK1水平均未发生明显变化。同时,SPNS2 sh RNA处理组明显降低HUVEC活力、增殖、迁移及管腔样结构形成,但当SPHK2人源重组蛋白恢复SPHK2表达后,上述趋势明显反转。并且,在SPNS2 sh RNA慢病毒基础上加入S1P激活受体表达后,SPHK2的表达与SPNS2 sh RNA慢病毒组并无显著差异。小结:SPNS2 sh RNA通过下调SPHK2的m RNA及蛋白水平抑制HUVEC增殖、迁移及管腔样结构形成,并且SPHK2的下调效应不依赖于胞外S1P信号途径。第四部分沉默SPNS2经线粒体SPHK2调节线粒体功能目的:研究SPNS2 sh RNA是否通过SPHK2影响PHB2及线粒体呼吸功能障碍进而调节HUVEC功能。方法:培养正常HUVEC,构建空载体稳转株,SPNS2 sh RNA慢病毒稳转株,实验分组如下:HUVEC+PBS,HUVEC+空载体慢病毒,HUVEC+SPNS2 sh RNA慢病毒,HUVEC+SPNS2 sh RNA慢病毒+SPHK2人源重组蛋白。利用线粒体荧光探针检测线粒体完整性;ROS检测试剂盒检测线粒体ROS水平;TMRE(Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate)试剂盒检测线粒体膜电位;线粒体蛋白提取试剂盒提取线粒体蛋白,WB检测线粒体中PHB2的蛋白表达水平。结果:与对照组及空载体组相比,SPNS2 sh RNA组线粒体完整性严重受损,膜电位水平显著降低,线粒体ROS异常增加,线粒体PHB2表达下调;而在SPNS2 sh RNA基础上加入SPHK2人源重组蛋白处理后,上述现象得到有效逆转。小结:SPNS2 sh RNA通过下调线粒体SPHK2破坏线粒体完整性,降低线粒体PHB2表达,影响线粒体呼吸链功能。结论1.MI大鼠心脏梗死区边缘侧枝循环形成明显增强,血管内皮SPNS2蛋白表达显著增加;2.SPNS2 sh RNA抑制HUVEC增殖、迁移和管腔样结构形成,胞外S1P不能完全逆转SPNS2沉默的效应;3.沉默SPNS2可显著降低胞内SPHK2表达水平,并经SPHK2调节HUVEC增殖、迁移和管腔样结构;4.SPNS2经线粒体SPHK2调节线粒体完整性、ROS生成、膜电位及PHB2。