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背景:肝纤维化(liver fibrosis)是多种慢性肝损害所致的可逆性病理改变,是肝硬化发展的必经阶段。其主要表现为肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)激活所致的肝细胞外间质成分过度异常沉积,影响肝脏的功能。目前肝纤维化在诊治方面虽然有一些进展,但仍缺乏确定有效的药物,且相关分子机制尚不完全明确。有研究表明Enhancer of Zeste Homolog 2(EZH2)在促进肌成纤维细胞(myofibroblast,MFB)分化中发挥重要作用,但其具体机制仍不完全清楚。鼠尾草酚(carnosol,CS)是迷迭香中提取的一种脂溶性有效成分,具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理活性,但其对肝纤维化的治疗作用国内外未见报道。目的:探究CS对肝纤维化的保护作用,以及Sirtuin 1(SIRT1)/EZH2在抗肝纤维化中的分子机制。方法:1.CS在大鼠肝纤维化中保护作用的研究60只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为五组:(A)空白对照组;(B)CS空白给药组(30mg/kg);(C)CCl4腹腔注射组;(D)CCl4+CS低剂量(15mg/kg)给药组;(E)CCl4+CS高剂量(30mg/kg)给药组。C、D、E组通过腹腔注射CCl4(0.5 mg/kg,按1:10比例稀释于橄榄油中,2次/周,4周)模拟肝纤维化模型,A、B组给予等量溶媒橄榄油腹腔注射;同时,B、D、E组每天通过灌胃方式给予不同浓度CS油溶液,A、C组给予等量溶媒橄榄油。四周后腹主动脉取血,分离肝脏组织标本。检测大鼠血清中谷丙氨酸氨基转移酶(Alanine Aminotransferase,ALT)、谷草氨酸氨基转移酶(Aspartate Aminotransferase,AST)活性。采用苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)和Masson染色法检查肝脏病理改变及胶原累积分布情况;通过Western Blot法检测肝组织SIRT1、EZH2、Collagen I、α-SMA、E-Cadherin、Vimentin等蛋白水平;real-time PCR法检测肝组织PPARγ、TIMP1、CTGF、Collagen I、α-SMA等的m RNA水平。2.CS对转化生长因子(transforming growth factorβ1,TGFβ1)诱导肝细胞损伤的保护作用及相关机制研究(1)AML-12、LX-2细胞分成四组:空白对照组;CS(10μM)组;TGFβ1(4ng/ml)组;CS(10μM)+TGFβ1(4ng/ml)组。CS预给药6h,TGFβ1诱导12h后提取细胞全蛋白。Western Blot法检测细胞内Collagen I、α-SMA表达情况。(2)AML-12、LX-2细胞分成五组:空白对照组;TGFβ1(4ng/ml)组;高、中、低剂量CS(2.5μM、5μM、10μM)+TGFβ1(4ng/ml)组。CS预处理6h,使用TGFβ1诱导12h后提取细胞全蛋白。Western Blot法检测细胞内Collagen I、α-SMA蛋白表达水平。(3)大鼠原代HSC、AML-12细胞分成四组:阴性对照(si-control)组;si-control+TGFβ1(4ng/ml)组;EZH2干扰(si-EZH2)组;si-EZH2+TGFβ1(4ng/ml)组。control si RNA/EZH2 si RNA转染48h,TGFβ1诱导12h后,提取细胞RNA或全蛋白。采用real-time PCR法检测EZH2、PPARγ、TIMP1、CTGF、Collagen I、α-SMA的m RNA表达情况;Western Blot法检测Collagen I、α-SMA、E-Cadherin、Vimentin蛋白表达水平;免疫荧光法观察细胞中E-Cadherin、Vimentin的分布和表达情况。(4)大鼠原代HSC、AML-12细胞分成五组:阴性对照(si-control)组;si-control+TGFβ1(4ng/ml)组;si-control+TGFβ1(4ng/ml)+CS(10μM)组;SIRT1干扰(si-SIRT1)+TGFβ1(4ng/ml)组;si-SIRT1+TGFβ1(4ng/ml)+CS(10μM)组。control si RNA/SIRT1 si RNA转染48h,CS作用6h,TGFβ1诱导12h后,提取细胞全蛋白或RNA。采用Western Blot法检测细胞内SIRT1、EZH2、Collagen I、α-SMA、E-Cadherin及Vimentin蛋白表达情况;real-time PCR技术检测PPARγ、TIMP1、CTGF、Collagen I、α-SMA的m RNA表达水平;免疫荧光方法观察细胞中E-Cadherin、Vimentin的分布和表达情况。(5)AML-12细胞分成四组:阴性对照(si-control)组;si-control+CS(10μM)组;SIRT1干扰(si-SIRT1)组;si-SIRT1+CS(10μM)组。control si RNA/SIRT1 si RNA转染48h,CS作用6h后Western Blot法检测细胞内SIRT1及EZH2的蛋白表达情况,免疫沉淀法检测EZH2蛋白的乙酰化水平。(6)AML-12细胞分成五组:阴性对照组(si-control);si-control+TGFβ1(4ng/ml)组;si-control+TGFβ1(4ng/ml)+白藜芦醇(resveratrol,Res,10μM)组;si-control+TGFβ1(4ng/ml)+CS(10μM)组;si-SIRT1+TGFβ1(4ng/ml)。control si RNA/SIRT1 si RNA转染48h后,CS/Res作用6h,TGFβ1诱导12h,提取细胞全蛋白或RNA。Western Blotting法检测细胞内SIRT1及EZH2蛋白表达情况;免疫沉淀法检测EZH2蛋白的乙酰化水平。(7)大鼠原代HSC、AML-12细胞分成四组:阴性对照(pc DNA3.1)组;pc DNA3.1+TGFβ1(4ng/ml)组;pc DNA3.1+TGFβ1(4ng/ml)+Res(10μM)组;EZH2过表达(pc DNA-EZH2)+TGFβ1(4ng/ml)+Res(10μM)组;转染pc DNA3.1/pc DNA-EZH2 48h后,Res作用6h,TGFβ1诱导12h。提取细胞RNA或全蛋白,采用real-time PCR技术检测TIMP1、CTGF、Collagen I、α-SMA的m RNA表达水平;Western Blot法检测细胞内E-Cadherin及Vimentin蛋白表达情况。结果:CCl4诱导的肝纤维化引起大鼠血清中ALT、AST上升,正常肝小叶结构丧失、炎症渗出、肝细胞排列紊乱、大量胶原纤维增生;CS治疗后能明显改善上述情况。CS上调肝组织中SIRT1,下调EZH2,抑制HSC激活及上皮间质转化(EMT)。机制上,CS对肝纤维化的保护作用与SIRT1的激活相关:上调SIRT1能通过抑制EZH2的乙酰化表达,影响其稳定性,从而减弱HSC激活及EMT,缓解肝纤维化。以上结果表明CS可通过激活SIRT1/EZH2信号通路减轻肝纤维化。结论:SIRT1/EZH2信号通路在肝纤维化中发挥重要作用;CS通过激活SIRT1降低EZH2的乙酰化水平,影响EZH2稳定性,从而抑制HSC激活及EMT,减轻肝纤维化。