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1目的以中医理论为指导,分析、总结血小板活化在类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)发病中的作用及其中医机制；通过动物实验,观察佐剂性关节炎(adjuvant arthritis, AA)大鼠血清血小板活化因子(platelet activating factor, PAF),外周血血小板参数、血小板α颗粒膜糖蛋白(granule membrane protein140, GMP-140)、血小板分化抗原40配体(cluster of differentiation40ligand, CD40L),胸腺GMP-140、CD40L、CD40L mRNA,血小板超微结构的变化及体质量、足跖肿胀度、关节炎指数(arthritis index, AI)、白细胞介素(interleukin, IL)-1、IL-6、IL-17、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α、IL-10的变化和健脾益气中药新风胶囊(Xinfeng Capsules, XFC)对AA大鼠的疗效及上述指标的影响,并基于血小板活化探讨XFC对AA大鼠的作用机制。从而丰富RA“从脾论治,整体调节”科学内涵,为中医药治疗RA的机理研究提供新的思路。2方法2.1理论研究通过文献研究,总结、分析血小板活化与中医血瘀证、RA、中医脾虚的关系。从中医理论角度,阐释RA血小板活化“从脾论治”的机制。2.2实验研究将40只SD (sprague dawley, SD)雄性大鼠按随机数字表分为5组：正常对照(normal control, NC)组、模型对照(model control, MC)组、雷公藤多甙片(tripterygium wilfordii polyglycoside tablet, TPT)组、甲氨喋呤(methotrexate, MTX)组和XFC组,每组8只,除NC组外,向每只大鼠右后足跖皮内注射弗氏完全佐剂(freund’s complete adjuvant, FCA)0.1ml致炎,复制成AA大鼠模型,于致炎后第19天开始给予相应药物治疗,①TPT组：将TPT研成细末,加生理盐水配制混匀,按10ml/kg灌胃,每天1次。②MTX组：将MTX研成细末,加生理盐水配制混匀,按10ml/kg灌胃,每周1次；未给药的实验日,给予生理盐水灌胃,10ml/kg,每天1次。③XFC组：将XFC去除胶囊壳研成细末,加生理盐水配制混匀,按10ml/kg灌胃,每天1次。④NC组及MC组予生理盐水灌胃,10ml/kg,每天1次,连续用药30天。实验过程中观察各组大鼠的体质量、足跖肿胀度、AI。实验结束后检测大鼠各指标：采用酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)法检测各组大鼠血清PAF、IL-1、IL-6、IL-17、TNF-α、IL-10的表达,流式细胞仪检测大鼠外周血GMP-140、CD40L表达,免疫组化法检测胸腺CD40L的表达,逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)法检测胸腺CD40L mRNA的表达,免疫蛋白印迹(western blotting, WB)法检测胸腺GMP-140的表达,透射电镜观察血小板超微结构的变化。3结果3.1理论研究结果3.1.1血小板活化在RA的发生、发展中起重要作用：血小板及其活化产物促进了RA滑膜炎症的发生与发展、滑膜组织的增生、血管翳的形成、软骨及骨破坏。3.1.2血小板活化是中医血瘀证本质的重要表现：血瘀证本质表现之一为血小板活化,血小板活化参与了血瘀证的发生与发展,是血瘀证产生的重要生理、病理基础。3.1.3血瘀证贯穿于RA病程的始终：血瘀在RA发病过程中既可成为主要的致病因素,又可作为主要的病理机制而贯穿于整个疾病的始终。3.1.4脾虚是RA血瘀证产生的重要因素：脾虚引起的运化失职、化源匮乏、脾不统血、阳虚寒凝均可致瘀。RA血小板活化的中医机制在于脾虚,应当“从脾论治”。3.2实验研究结果3.2.1从大鼠血小板参数、活化指标及超微结构的变化：与NC组比较,Mc组AA大鼠血清PAF,外周血PLT、PCT、GMP-140、CD40L,胸腺GMP-140、 CD40L、CD40L mRNA表达显著升高(P<0.01),血小板超微结构破坏严重。3.2.2从大鼠体质量、足跖肿胀度、AI的变化：致炎前,各组大鼠的体质量比较,差异无统计学意义(P>0.05)；给药前1d,与Nc组相比,Mc组大鼠体质量明显减轻(P<0.05),足跖肿胀度、AI显著升高(P<0.01)。3.2.3从大鼠细胞因子IL-1、IL-6、IL-17、TNF-α、IL-10的变化：与NC组相比,MC组大鼠IL-1、IL-6、IL-17、TNF-α明显升高(P<0.01),IL-10显著降低(P<0.01)。3.2.4从大鼠血小板活化指标与血小板参数、足跖肿胀度、AI、IL-1、 IL-6、IL-17、TNF-α、IL-10的相关性：AA大鼠血清PAF,外周血GMP-140、 CD40L,胸腺GMP-140、CD40L、CD40L mRNA与PLT、PCT、IL-1、IL-6、 IL-17、TNF-α、足跖肿胀度、AI呈正相关,与IL-10呈负相关(P<0.01或P<0.05)。3.2.5XFC对从大鼠血小板参数及活化指标的影响：与MC组相比,XFC可以显著降低AA大鼠血清PAF,外周血PLT、PCT、GMP-140、CD40L,胸腺GMP-140、CD40L、CD40L mRNA的表达水平(P<0.01或P<0.05)；与MTX组、TPT组相比,XFC组血清PAF、胸腺GMP-140表达水平显著降低(P<0.05),外周血GMP-140、胸腺CD40L mRNA呈下降趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。3.2.6XFC对从大鼠血小板超微结构的影响：XFC组血小板表面伸出细伪足或小的突起,开放管道细,数量少,血小板α颗粒较前明显增多,线粒体大部分完好,少数肿胀,超微结构较Mc组、MTX组、TPT组有所改善。3.2.7XFC对AA大鼠体质量、足跖肿胀度、AI的影响：XFC组大鼠的体质量显著高于Mc组、MTX组及TPT组(P<0.01或P<0.05),与Nc组无显著差异(P>0.05)；MTX组、TPT组、XFC组三个治疗组AA大鼠足跖肿胀度、AI显著低于Mc组(P<0.01),各治疗组间相比,足跖肿胀度、AI差异无统计学意义(P>0.05)。3.2.8XFC对细胞因子IL-1、IL-6、IL-17、TNF-α、IL-10表达的影响：XFC能够降低血清IL-1、IL-6、IL-17、TNF-α表达,升高IL-10(P<0.01),与MTX组、TPT组相比,XFC组IL-10显著升高(P<0.05),IL-17呈下降趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。4结论4.1血小板活化在RA的发生、发展中发挥重要作用,其中医机制在于脾虚,应当“从脾论治”。4.2AA大鼠存在血小板活化,表现为血清PAF,外周血PLT、PCT、GMP-140、 CD40L及胸腺GMP-140、CD40L、CD40L mRNA表达升高。4.3AA大鼠血小板活化与炎症密切相关,表现为血小板活化指标PAF、 GMP-140、CD40L与致炎因子IL-1、IL-6、IL-17、TNF-α,抑炎因子IL-10及足跖肿胀度、AI具有相关性。4.4XFC对AA大鼠体质量、足跖肿胀度、AI具有良好的调控作用。5基于血小板活化XFC对AA大鼠的作用机制5.1XFC能通过抑制AA大鼠血小板活化而调节细胞因子在炎症中的表达,从而降低足跖肿胀度、AI。5.2XFC能通过降低AA大鼠血清PAF,外周血PLT、PCT、GMP-140、CD40L的表达,抑制血小板活化介导的炎症反应,从而降低足跖肿胀度、AI。5.3XFC能通过降低AA大鼠胸腺GMP-140、CD40L、CD40L mRNA的表达,抑制血小板活化介导的炎症反应,从而降低足跖肿胀度、AI。5.4XFC能通过改善AA大鼠血小板超微结构,抑制血小板活化介导的炎症反应,从而降低足跖肿胀度、AI。