前言卡培他滨（capecitabine,CAP）是一种口服型5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）前体类抗肿瘤新药。CAP的药物设计,使其本身无毒无活性,在胃肠道可以原药形式快速吸收,在肝脏和肿瘤组织中三种酶的作用下转化形成5-FU而发挥抗肿瘤活性。最终5-FU由二氢嘧啶脱氢酶（dihydropyrimidine dehydrogenase,DPD）代谢失活。在其转化过程中,胸腺嘧啶核苷磷酸化酶（thymidine phosphorylase,TP）是其活化最后一环的一个限制酶,TP的特点在多数实体肿瘤组织中浓度较高,明显高于正常组织。这使得CAP在正常组织中生成5-FU量较少,而在肿瘤组织局部可有高浓度5-FU生成,大大增强了抗肿瘤活性,降低了5-FU对正常组织的毒副作用。因此,CAP全身毒性反应轻且选择性抗肿瘤,是目前口服制剂中唯一能超过静脉给药的氟尿嘧啶类药物,弥补了5FU毒性大用量受限的缺撼。临床上已被用于紫杉醇、阿霉素等耐药的复发转移性乳腺癌及晚期结肠癌等患者的治疗,取得了很好的效果。关于CAP疗效方面的研究,由于TP是CAP选择性作用于肿瘤的关键酶,而成为研究的焦点。人们致力于增加TP的表达来提高CAP的疗效。研究显示,放射可使多种肿瘤组织TP表达明显增高,CAP和放射联合应用无论用于辅助治疗、术前放化疗、还是姑息治疗,均能得到较好的效果,是一种有前途的肿瘤治疗方法。另外研究还发现,DPD在CAP治疗中也发挥着重要作用,TP/DPD的比值更直接的关系到CAP的疗效。提示在化疗之前测定肿瘤相关酶的水平,能选择到更适合接受CAP治疗的人群。子宫颈癌有着较高的发病率,其治疗主要还是以手术和放疗为主,可使部分患者得到根治或缓解,但有部分患者单纯放疗仍然预后不佳。尤其是宫颈腺癌,不如宫颈鳞癌对放射线敏感,临床期别较晚、淋巴结有转移的患者,初始治疗后很快又复发、转移。且其发病还有逐渐增加趋势。因此为改善预后,临床迫切需要探讨对宫颈腺癌更为有效的疗法。近年来新辅助化疗即术前或放疗前进行化疗,确实一定程度上提高了手术或/和放疗的效果。故而寻找对宫颈腺癌更有效的新辅助化疗方案的有关研究出现许多。CAP也已被用于多种人宫颈癌细胞株动物移植模型中进行研究,显示出了一定的抑癌效果,在人宫颈腺癌HeLa细胞株动物移植模型中CAP的抑瘤率可达34.6%。但CAP与放射联合在宫颈腺癌中的作用如何尚未见报道。介于CAP高效低毒的药物特点和5-FU所具有的放射增敏作用,将CAP与放射联合用于宫颈腺癌,效果值得期待。因此本研究采用人子宫颈腺癌细胞株异种移植于裸鼠建立动物模型,观察了CAP和放射线联合治疗在宫颈腺癌中的抗肿瘤效果。并通过放射线照射对宫颈腺癌细胞TP、DPD酶影响的研究,及观察联合治疗后宫颈腺癌细胞周期的变化,对其联合治疗效果的机制进行了探讨。实验材料和方法一、实验材料1、实验动物:雌性BALB/c nu/nu裸鼠（5或6周龄,体重约20克）约220只。2、细胞株:人宫颈腺癌CAC-1细胞株从日本札幌医科大学获得,人宫颈腺癌HeLa细胞株由中国医科大学盛京医院感染科实验室提供。3、主要试剂及药品:CAP由F-Hofmann-Roche（Besle Switzerland）提供。5-FU购买于Kyowa Hakko Co（Tokyo Japan）和上海旭东海普药业公司。培养基（海克隆生物化学制品北京有限公司）;0.1mg/ml考马斯亮蓝溶液（进口分装,上海化学试剂采购供应站）;牛血清白蛋白（Sigma公司）;ELISA法测定TP酶的试剂盒（德国罗氏公司）;总RNA提取液Trizol（东胜创新实验技术有限公司）;cDNA第一链合成逆转录试剂盒、PCR试剂盒、Taq DNA、聚合酶DNA Marker（大连宝生物工程有限公司）;TP、DPD引物（上海Invitrogen英俊生物技术有限公司合成）;四甲基偶氮唑蓝（MTT）（Sigma公司）,DMSO试剂二甲基亚砜（北京夏斯生物技术有限公司）,碘化丙啶（PI）（sigma公司）。4、主要实验仪器和设备:超净工作台（苏州净化设备厂）;瓦里安直线加速器2300C/D-SN293（美国）;超声粉碎机UP200H（德国）;DV600分光光度计（美国）;振荡机RS-232（美国）;酶标仪GIS-1000 Tanon（上海天能科技有限公司）;紫外分光光度仪Wellscan MK3（德国）;电泳仪BIO-RADpower/PAC 300（美国）;PCR仪PTC-100（美国）;凝胶成像分析系统（基因有限公司）;流式细胞仪（FACS-440型）;Mitsubishi电子射线装置（机型EXL-15DP,4MeV,剂量率5Gy/分）。二、实验方法1、人宫颈腺癌CAC-1细胞株动物移植模型建立及治疗效果评价在每只裸鼠左下肢外上方皮下,接种含2×10⁶个细胞的CAC-1单细胞悬液0.2ml。在局部有肿瘤块生长并达一定程度时开始进行肿瘤治疗。治疗前将携瘤鼠分成对照组、CAP组、5-FU组、放射组、CAP+放射组和5-FU+放射组。并设肿瘤大小不同的两大组,在大、小瘤组又分别分出对照组、CAP组、放射组、CAP+放射组。CAP、5-FU每天被分别投给它们最大耐受剂量（MTD）的1/2或2/3。每周投药6天,连续投药两周。对需行放射的携瘤鼠分别于投药第4天进行一次性4、5、6Gy局部照射,以及投药周的第1、2、4、5天进行日一次2Gy的局部照射,两周共照射8天。药物、照射等的疗效评价通过观察肿瘤体积的变化来进行。计算肿瘤增殖百分率,将肿瘤增殖百分率与所经过的时间绘制成肿瘤增殖曲线图,以此评价肿瘤被抑制程度。T2.5表示肿瘤体积从治疗第1天的体积到生长达其2.5倍时所需的时间,以此推算肿瘤生长延迟天数。2、人宫颈腺癌HeLa细胞TP,DPD酶表达的测定将宫颈腺癌HeLa细胞按X线照射的不同剂量分成对照组（0Gy）及2Gy、6Gy放射组。分别于照射前1天（第0天）,照射后第1天,第3天,第5天,第7天,第9天收集细胞,制成测定样本冻存。ELISA测定HeLa细胞照射前后TP酶蛋白含量。RT-PCR检测HeLa细胞放射前后TP,DPD酶mRNA表达。3、人宫颈腺癌HeLa细胞周期的测定先以MTT法行5-FU处理48h半数抑制浓度（IC50）测定,为125μg/ml。再将HeLa细胞分成对照组（不加药,不照射）、5-FU组、放射组、5-FU+放射组（药物和放射同时投给）。各组根据不同时间经过又分成12、24、48h三组。药物组是以48h IC50浓度的5-FU处理相应各组细胞,12、24、48h后将细胞收集。需照射的各组细胞在室温下进行单次6Gy的X射线照射,照射后继续培养12、24、48h再收集细胞。行冰乙醇固定备测。细胞周期测定前先行PI染色,后以流式细胞仪检测各组细胞周期变化,测定G₀/G₁、S、G₂/M期细胞。实验结果1、不同剂量的单纯药物及单纯放射的治疗效果2/3MTD药物（CAP、5-FU）和4、5、6、2×8Gy放射分别施与后的效果,与对照组相比,单纯CAP治疗显示了一定的抑制效果,并且效果要好于5-FU,与单纯6Gy放射相比两者效果近似。而不同剂量的单纯放射治疗组与对照组相比,2Gy×8回放射在各治疗条件中显示出的抑制效果最好,持续抑制的时间也长,其次是6Gy放射。总的来看子宫颈腺癌CAC-1对单纯CAP及单纯放射都有一定的效果,但不明显。1/2MTD CAP、6Gy放射施与后的结果,CAP的抑制效果也近似于单纯6Gy放射的效果,二者联合的效果虽有,但也不是很明显。2、药物与不同剂量放射及不同方法放射联合施与后的治疗效果与对照组相比2/3MTD CAP分别和各个不同剂量放射联合施与的抑制效果,均较单纯药物或单纯放射显示的效果明显。2/3MTD 5-FU和6Gy放射联合施与的抑制效果,明显不如2/3MTD CAP和6Gy放射联合的效果,只见到了延缓生长作用,没有消瘤作用。2/3MTD CAP分别和5、6、2×8Gy剂量放射联合施与后的抑制效果明显,在治疗后的一周开始明显显示,不仅使肿瘤生长延迟而且有消瘤作用,抑制效果并能持续一周左右;特别在与2Gy/日×8回的小剂量多次放射方法联合施与后,其显示出的抑制效果,较CAP分别和5、6Gy单次放射方法联合的效果更为明显,并且显效快抑瘤时间长;而CAP与4Gy放射联合施与后的效果不佳。另外2/3MTD CAP和4Gy放射联合的效果与2/3MTD 5-FU和6Gy放射联合的效果相近,提示放射与CAP联合治疗,同样效果需要的射线剂量小,CAP对放射的增强作用比5-FU强。3、不同大小肿瘤对CAP与放射联合治疗效果的影响,1/2MTD CAP和6Gy放射联合施与,大瘤组肿瘤对联合治疗反应敏感,有明显抑制。而小瘤组肿瘤对联合治疗反应不敏感,效果仅同于单纯药物或单纯放射的治疗效果。2/3MTD CAP和6Gy放射联合施与,加大CAP剂量后,虽然大、小瘤组肿瘤均对联合治疗有效,但大瘤组肿瘤受抑明显,优于小瘤组肿瘤。4、从肿瘤生长延迟天数来看,CAP分别和6、5、2×8Gy放射联合施与的三个治疗组,肿瘤生长分别被延迟了23.9、22、48.4天。各联合治疗组的肿瘤生长延迟天数,都超过了它们单纯药物组及相应的单纯放射组延迟天数的总和,延迟天数并非为单纯药物组及相应的单纯放射组延迟天数的简单相加。5、放射后HeLa细胞TP酶蛋白含量的ELISA测定与对照组相比,HeLa细胞照射后,两个放射组的TP酶蛋白水平均有明显提高,放射后第3天都升高达高峰,以后逐渐下降,持续高水平约有一周左右时间。2Gy放射组TP酶蛋白水平升高程度,较6Gy放射组升高有更加明显的趋势,尤其放射后第3天两者的差别显著。2Gy放射组TP酶处于高水平的持续时间更长,超过9天。6、放射后HeLa细胞TP、DPD酶mRNA表达RT-PCR检测放射后HeLa细胞TP酶的mRNA表达,在照射后第3天迅速升高达到高峰,明显高于未经照射的对照组,以后出现逐渐下降的趋势。其升高时间与ELISA测定的TP酶蛋白水平的变化情况基本相吻合。而HeLa细胞DPD酶mRNA的表达,在放射组与对照组之间未见明显差异。7、HeLa细胞周期构成比的变化与对照组比较,5-FU处理组HeLa细胞S期增加明显,G₂/M期及G₀/G₁期比例减少,出现S期明显阻滞,药物处理24小时后阻滞最显著;X线照射组G₀/G₁期细胞有所增加,而S期细胞减少,照射24小时后变化最明显;5-FU与放射联合组对HeLa细胞的影响,主要是S期增多5-FU的作用为主,G₀/G₁期细胞明显减少。G₂/M期也有减少,但联合作用组G₂/M期细胞减少没有5-FU组那么明显。5-FU与放射联合作用时,HeLa细胞G₂/M、S及G₀/G₁各期细胞均受影响,但其对5-FU的反应比对放射线更敏感。联合作用引起的细胞周期变化也是处理后24小时最显著;照射前、后的HeLa细胞,均是5-FU处理组引起了S期阻滞,而单纯照射前、后HeLa细胞S期比例变化不大。结论1、对于宫颈腺癌CAC-1应用CAP与放射联合治疗能产生相互协同增效作用,有明显的肿瘤抑制效果,是一种有效的治疗子宫颈腺癌的方法。其效果优于单纯CAP及单纯放射的治疗,也优于5-FU直接和放射联合的效果。CAP对放射的增强作用比5-FU强。2、CAP与放射联合治疗的效果与CAP药物浓度、放射剂量、照射方法及肿瘤大小有关。2/3MTD CAP分别和5、6Gy及2Gy×8放射联合治疗时,肿瘤抑制的效果较好。CAP与小剂量多次放射方法的联合治疗,较CAP与单次放射方法联合,更显示出了明显的抑瘤效果。体积较大的肿瘤,对CAP与放射联合治疗的反应敏感,比体积较小的肿瘤治疗效果好,可能CAP与放射联合治疗对较晚期子宫颈腺癌更为有效。3、放射线照射,能提高子宫颈腺癌HeLa细胞TP酶的mRNA表达和TP酶蛋白水平,而DPD酶mRNA表达不受影响,因此放射后HeLa细胞TP/DPD比值升高,能增加其对CAP的敏感性。4、5-FU与放射联合,两者对HeLa细胞周期均有影响,其细胞G₂/M、S及G₀/G₁各期都有变化,但主要还是以S期细胞阻滞即5-FU的影响为主。其联合作用引起的细胞周期变化,在处理后的24小时最为显著。HeLa细胞表现出对5-FU的作用比对放射更敏感,可以认为在两者的联合作用中,5-FU通过改变HeLa细胞周期而对放射效果的影响较大,相反放射对5-FU影响较小。