百合花粉丝束蛋白LFIM1的生化特性及功能研究

来源 :北京师范大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:qinglong21
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微丝骨架在花粉管的极性生长过程中发挥着重要的调控作用。花粉管不同区域有明显不同的微丝排布。目前人们对在花粉管主干部位形成的微丝束的结构及其功能已有较多的了解,而对于顶端及在亚顶端区域出现的致密的微丝刷状环结构的形成及维持的机制还不甚清楚。   我们从百合(Liliumlongiflorum)花粉中克隆了一个全长为2606bp的cDNA序列,它编码一个分子量为77kD的丝束蛋白(fimbrin),我们将它命名为LFIM1。LFIM1在花粉中大量表达。体外生化结果表明LFIM1重组蛋白能够与微丝直接作用并具有较强的微丝结合能力,同时,该蛋白能够交联微丝而形成微丝束,它的成束作用不受Ca2+浓度的影响。另外,在酸性(pH6.2)和碱性(pH7.4)条件下该蛋白都具有成束作用。为了探究该蛋白的亚细胞定位,我们首先以LFIM1的C端片段为抗原制备了特异性抗体,然后用LFIM1的特异性抗体进行细胞免疫荧光实验,结果表明LFIM1与花粉管亚顶端的微丝刷状环及干部纵向排列的微丝束共定位。通过显微注射将该特异性抗体注入百合花粉管后,花粉管的极性生长速度减慢,观察其微丝结构发现花粉管亚顶端区域的微丝刷状环结构被破坏,而主干部的微丝束没有受到明显影响。结果暗示着LFIM1可能主要参与了亚顶端微丝刷状环结构的维持和稳定。将GFP-LFIM1在百合花粉中过表达后,该蛋白在花粉管中呈现弥散分布,花粉管的极性生长没有受到影响。我们推测这可能是由于内源的LFIM1已处于饱和状态,占据了微丝结合位点而导致GFP-LFIM1不能与微丝发生作用,从而过表达GFP-LFIM1后对花粉管没有作用。   拟南芥中有5个fimbrin同源蛋白,其中AtFIM5在花粉中高表达。序列比对和进化分析结果表明,LFIM1与AtFIM5高度同源:在核心结构域上,有高达98%的氨基酸是相似的。为了进一步验证LFIM1蛋白在花粉管生长中的作用,我们探索了atfim5突变体的表型,并通过回补实验证实了LFIM1在拟南芥花粉管中也发挥着相似的作用。萌发早期的atfim5突变体花粉管形态发生异常,直径变大,但随着培养时间的延长,突变体花粉管的形态能够逐渐恢复。在整个极性生长过程中,atfim5突变体花粉管的生长速度均比野生型慢。与之相伴随的是其亚顶端区域的微丝刷状环结构受到明显破坏。即突变体具有的表型与在百合花粉管中注射LFIM1抗体的结果非常相似。另一方面,将atfim5pro-GFP-LFIM1融合片段转化入<中文标题>=atfim5突变体后,突变体花粉管亚顶端被破坏的微丝刷状环结构得到恢复,同时其生长速度恢复正常。   综合以上研究结果,我们认为LFIM1可能通过成束作用而参与花粉管亚顶端微丝刷状环结构的稳定,从而维持花粉管的极性生长速度。
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