研究背景急性肾损伤(acute kidney injury, AKI)，主要是由肾缺血或肾毒性药物而导致的一类重症疾病，临床主要表现为血肌酐和尿素氮水平的急剧增高，其中绝大部分的患者肾脏病理表现为急性肾小管坏死(acute tubular necrosis, ATN)。目前已有的研究表明，AKI的主要发病机制包括线粒体破坏、炎症反应、氧化应激反应及肾小管上皮细胞坏死和凋亡等；其中炎症及凋亡反应在AKI的病程进展中起着极其重要的作用。研究发现，AKI肾组织中的炎性因子IL-1β及IL-18表达及肾小管上皮细胞凋亡显著增加，很可能参与了AKI发病的过程。然而，AKI中诱发炎症因子IL-1β、IL-18水平上调及肾小管上皮细胞凋亡增加的具体机制迄今尚无研究报道。由于AKI有着十分复杂的发病机制，且目前仍缺乏有效的治疗手段，故关于AKI的具体发病机制及防治的研究已经成为肾脏病学领域亟待解决的问题之一。目前研究认为，IL-1β、IL-18的活化以及细胞凋亡均与嘌呤受体P2Xs (Purinergicreceptor X, P2Xs)密切相关。P2Xs是阳离子通道型受体，活化后可以诱导细胞内ROS产生、活化下游信号通路、参与免疫反应以及引起活性的促炎细胞因子IL-1β、IL-18、IL-6等释放。研究发现，P2Xs嘌呤受体家族成员——P2X7受体在肾小球系膜细胞、足细胞及肾小管上皮细胞等肾组织细胞中均有表达，还与肾脏疾病状态有着重要的联系。P2X7作为NALP3(NLR family, pyrin domain containing-3protein，NLRP3or NALP3)的主要的上游受体，与NALP3关系最为密切。NLRs(NOD like receptors)炎性体是近年发现的模式识别受体家族成员之一，NLRs受体根据N端效应区域的不同，可分为NLRA、NLRB、NLRC及NLRP(NALP)四个亚型。NLRs是构成炎性体的核心蛋白，而目前研究主要集中于NLRP1、NLRP3及NLRC4这3种亚型，发现NLRP1、NLRP3及NLRC4均能发起炎性体的装配。其中NLRP3炎性体又称NALP3炎性体，主要由NALP3、ASC和caspase-1组成，在如新月体肾炎、狼疮性肾炎等炎症相关性肾病的过程中发挥了重要的调节作用。目前研究表明，P2X7受体活化是诱发NALP3炎性体活化的重要原因，同时也是导致促炎因子IL-1β、IL-18表达上调及细胞凋亡增加的重要始动因素。还有研究发现，坏死的小管上皮细胞可以引起成纤维细胞中P2X7受体的表达上调，加重肾间质纤维化程度，揭示了P2X7受体可能与肾小管上皮细胞损伤存在密切关系。然而P2X7受体是否引起了AKI中促炎因子IL-1β、IL-18表达上调及肾小管上皮细胞凋亡增加，NALP3炎性体活化是否是其重要机制，目前仍尚不十分清楚。研究目的本研究拟先检测AKI患者肾脏组织中促炎因子IL-1β、IL-18水平及小管上皮细胞凋亡情况，探讨AKI患者肾组织中炎症及凋亡反应状态，并检测患者肾组织中P2X7受体及NALP3炎性体的表达，探讨AKI肾组织中促炎因子IL-1β、IL-18活化及小管上皮细胞凋亡的可能作用机制。同时建立顺铂诱导急性肾损伤小鼠(C57B/6J)模型，并通过A-438079阻断P2X7的活性，检测AKI小鼠肾组织中P2X7受体、NALP3炎性体表达变化，并对AKI小鼠肾组织促炎因子IL-1β、IL-18表达水平、间质炎症细胞浸润、小管上皮细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达进行检测，深入探讨P2X7受体在炎症及凋亡反应中的作用及其可能的机制。研究方法1.临床标本有关实验1.1研究对象及分组依照2005年9月急性肾脏损伤网络(AKIN)推荐的ATN诊断标准。选取了2011年10月~2013年3月在第三军医大学附属第二医院肾内科住院，临床和肾活检诊断为ATN的25例AKI患者，其中包括13例男性，12例女性，年龄在22.0～60.0岁间，平均39.0岁。选取9例来自肾错构瘤患者外科手术后切除的正常的肾组织作为对照组，其中包括3例男性，6例女性，年龄在17.0～34.0岁间，平均27.3岁。1.2检测指标及方法收集并整理AKI患者入院时血肌酐(serum creatinine, Scr)及尿素氮(serumcreatinine, BUN)等数据，按照肾小球率过滤(estimated glomerular fitration rate, eGFR)的公式:)，计算出AKI患者的eGFR值。对照组及AKI患者肾脏组织石蜡组织切片，免疫组织化学测定AKI肾组织小管上皮细胞中P2X7、NALP3、caspase-1、caspase-3、IL-1β、IL-18的表达变化；TUNEL染色法检测两组肾组织中细胞凋亡情况并计数发生凋亡的细胞；观察肾组织中肾小管损伤、肾间质炎性细胞浸润情况并进行半定量积分后进行相关性分析。2.体内实验40只，8-10周龄，雄性C57B/6J小鼠，随机分为10只/组，包括对照组(腹腔注射生理盐水0.2ml/只)、A-438079组(7mg/mlA-438079腹腔注射0.2ml/只)、顺铂组(AKI组，2mg/ml顺铂腹腔注射0.2ml/只)和A-438079干预组(A-438079+顺铂组，7mg/mlA-438079腹腔注射0.2ml/只6h后，2mg/ml顺铂腹腔注射0.2ml/只)。注射72h后，从各组中随机取6只小鼠处死，留取血液及肾组织作以下检测：2.1．采用全自动生化分析仪对各组小鼠血清中Scr及BUN的表达进行检测。2.2．采用PAS染色法对各组小鼠肾脏病理损伤情况进行检测。2.3．采用免疫荧光法对各组小鼠肾脏组织中P2X7受体的表达情况进行检测。2.4．采用TUNEL法检测各组肾小管上皮细胞凋亡情况。2.5．采用Western blot法对NALP3、ASC、caspase-1、caspase-3、P53、bax蛋白在各组小鼠肾脏组织中的表达进行检测。2.6．采用ELISA法对各组小鼠肾组织中IL-1β和lL-18的表达进行检测。实验结果1.临床实验1.1一般情况与对照组相比较，AKI组患者Scr及BUN水平均明显增加(P<0.05)，尿量及eGFR显著降低(P<0.05)。1.2AKI患者肾小管上皮细胞中IL-1β、IL-18表达及凋亡情况与肾功能改变、肾小管损伤的关系免疫组化结果提示，AKI组肾组织小管上皮细胞中IL-1β、IL-18的表达显著升高；TUNEL染色发现，对照组肾组织小管上皮细胞凋亡较少，而AKI肾组织小管上皮细胞凋亡显著增多(P<0.05)。Pearson相关性分析显示，AKI患者肾组织中小管上皮细胞IL-1β、IL-18表达与小管损伤(r=0.580，r=0.531)、间质炎细胞聚集(r=0.420，r=0.741)及caspase-1表达(r=0.685，r=0.609)呈显著正相关相关，与eGRF(r=-0.511，r=-0.686)呈负相关；肾小管上皮细胞凋亡与小管损伤(r=0.743)、caspase-3的蛋白水平(r=0.482)均呈正相关，与eGRF(r=-0.609)呈负相关(P<0.05)。1.3AKI患者肾小管上皮细胞中P2X7与NALP3的表达情况与肾功能改变、肾小管损伤、炎症因子表达及凋亡的关系免疫组化结果提示，AKI肾小管上皮细胞P2X7、NALP3表达明显升高，且分别与Scr(r=0.707，r=0.706)和BUN(r=0.584，r=0.623)水平、肾小管损伤(r=0.787，r=0.530)、间质炎症(r=0.543，r=0.419)、caspase-1表达(r=0.666，r=0.687)、caspase-3表达(r=0.528，r=0.512)、IL-1β(r=0.558，r=0.555)及IL-18(r=0.459，r=0.574)的表达量、肾小管上皮细胞凋亡细胞数(r=0.719，r=0.671)成正相关；与eGFR(r=-0.622，r=-0.59)成负相关关系(P<0.01)。2动物实验2.1顺铂诱导小鼠产生急性肾损伤。(1)顺铂组：与对照组相比，顺铂腹腔注射72h后，小鼠Scr及BUN水平升高(P<0.05)，且出现明显的间质炎细胞聚集和典型的急性肾损伤病理表现(P<0.05)。(2)A-438079干预组:与顺铂组相比，顺铂腹腔注射72h后，小鼠血清中Scr及BUN含量增加程度不明显(P<0.05)，间质炎细胞聚集减少、小管病变明显减轻(P<0.05)，提示A-438079能有效地减轻顺铂诱导的肾组织损伤。2.2.顺铂诱导AKI小鼠肾组织中P2X7受体表达上调。(1)顺铂组：与对照组相比，顺铂腹腔注射72h后，小管上皮细胞中P2X7染色阳性的小管上皮显著增多(P<0.05)。(2)A-438079干预组:与顺铂组相比，P2X7表达明显下降(P<0.05)，表明A-438079能明显降低P2X7受体的活性。2.3.顺铂诱导AKI小鼠肾小管上皮细胞凋亡增多。(1)顺铂组：与对照组相比，顺铂腹腔注射72h后，凋亡的肾小管上皮细胞明显增多(P<0.05)；caspase-3、p53及bax的表达增加(P<0.05)。(2)A-438079干预组:与顺铂组相比，凋亡的肾小管上皮细胞减少(P<0.05)，caspase-3、p53及bax的表达下降(P<0.05)，提示A-438079能有效地减少顺铂引起的小管上皮细胞凋亡。2.4.顺铂诱导AKI小鼠肾组织NALP3炎性体活化，IL-1β、IL-18水平升高。(1)顺铂组：与对照组相比，顺铂腹腔注射72h后，小鼠肾组织NALP3、ASC和caspase-1蛋白显著上调(P<0.05)；促炎因子IL-1β及IL-18的含量较对照组明显增加(P<0.05)。(2) A-438079干预组:与顺铂组相比，NALP3、ASC和caspase-1蛋白上调程度不明显(P<0.05)；肾组织中促炎因子IL-1β及IL-18的含量增加的程度也低于顺铂组(P<0.05)，表明A-438079能有效地抑制顺铂诱导的NALP3炎性体的活性，抑制肾组织中促炎因子IL-1β及IL-18的增加。结论1. NALP3炎性体很可能是AKI的重要发病机制之一。2. P2X7受体通过NALP3炎性体介导AKI炎症及肾小管上皮细胞凋亡反应。