研究背景与研究目的随着社会物质的极大丰富及饮食结构的巨大改变,世界人口中血脂异常人群的比例明显高于以前。血脂异常作为代谢综合症的组分之一,与多种疾病如肥胖症、2型糖尿病、高血压、冠心病、脑卒中等密切相关。长期血脂异常可导致动脉粥样硬化、增加心脑血管病的发病率和死亡率。动脉粥样硬化性疾病已成为全世界人群死亡的主要原因,占总死亡率的50%。动脉粥样硬化的形成是一个需要经历许多年过程。内皮激活／损伤,LDL摄取、滞留和氧化,单核细胞浸润转变成巨噬细胞并最终变成富含脂质的泡沫细胞,动脉中层平滑肌细胞增殖迁移至内膜,以及血栓形成构成动脉粥样硬化病变。过多的胆固醇被巨噬细胞吞噬后变成了泡沫细胞,此过程是动脉粥样硬化的早期重要特征,也是动脉粥样硬化病变的起始机制和重要病理基础。胆固醇从巨噬细胞流出可以防止动脉粥样硬化的进展。HDL-C与其他脂蛋白相比,最主要特点是颗粒最小,密度最高,蛋白质和脂肪含量约各占一半,载脂蛋白以ApoA Ⅰ和ApoA Ⅱ为主。HDL的生理功能是将外周组织包括动脉壁在内的胆固醇转运到肝脏进行代谢,这一过程称为胆固醇的逆转运,是HDL抗动脉粥样硬化作用的主要机制。胆固醇的逆转运是机体排除过多胆固醇的唯一途径,对维持生物体胆固醇代谢稳态具有重要意义,也是目前认为机体对抗动脉粥样硬化发生的主要机制之一。胆固醇逆转运的影响因素及调控机制多而复杂。ATP结合盒转运子A1(ABCA1)是一种整合膜蛋白,它以ATP为能源,促进细胞内游离胆固醇和磷脂流出至细胞外贫脂的ApoA I。ABCA1基因突变的Tangier病患者和ABCA1基因敲除的小鼠均表现出细胞内胆固醇外流障碍。ABCA1首先介导泡沫细胞内的磷脂流出,磷脂流出后与细胞外ApoAⅠ结合,形成盘状复合物；在其诱导下,使细胞内的游离胆固醇流出并与该复合物相结合,从而形成前β-HDL,接着在卵磷脂胆固醇酯酰转移酶作用下,前β-HDL转变为成熟的HDL。因此,ABCA1是调节细胞内胆固醇外流关键的限速蛋白,ABCA1在胆固醇逆转运过程中发挥了非常关键的作用。ABCA1在体内的表达受多个因素所调节,研究较多的是核受体家族,如过氧化物酶体增殖激活型受体(PPARs)、肝孤儿受体(LXR)、视黄醇X受体(RXR)等,它们均可在转录水平调控ABCA1的表达。PPARs包括PPAR-α, PPAR-β和PPAR-γ三种亚型。其中PPAR-γ是核受体家族最重要的成员之一,现在认为PPAR-γ参与调节巨噬细胞脂质代谢和细胞分化。PPAR-γ作为一个关键的转录调节因子,可调控多个介导胆固醇转运的基因表达。LXR是核受体超家族成员,有LXRα和LXRβ两种亚型。LXRα可调节肝脏、巨噬细胞和小肠内胆固醇代谢相关的许多靶基因。研究证实,LXR激动剂可上调巨噬细胞ABCA1的表达,导致细胞内胆固醇的流出。丹酚酸B (Salvianolic acid B, Sal B)是提取的丹参干燥根及根茎中的有效成分。Sal B为一分子咖啡酸和三分子丹参素缩合而成,是丹参活性最强的水溶性提取物之一,也是研究较多的丹参酚酸。以往的研究已证实,Sal B能改善血流动力学,降低氧化损伤和修复血管内皮功能。在过去的几年中Sal B以及其他的丹参提取物质在中国甚至有些西方国家已广泛用于动脉粥样硬化性血管疾病包括冠心病和中风。Sal B能够清除羟自由基,超氧阴离子自由基,抑制脂质过氧化,因而被视为一种抗氧化剂。Sal B被证实是一种有效的CD36拮抗剂,抑制巨噬细胞依赖于CD36对修饰型低密度脂蛋白的摄取。Sal B能抑制血小板的聚集和活化,通过降低基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9稳定粥样斑块改善预后。在饮食诱导的高胆固醇血症兔模型中,Sal B能抑制LDL的氧化修饰,降低血浆胆固醇水平,改善内皮损伤和动脉粥样硬化的严重程度。上述研究结果表明,胆固醇逆转运被证实是脂质代谢HDL防止动脉粥样硬化的主要机制。Sal B在脂质代谢和抗动脉粥样硬化过程中扮演了重要角色。然而,目前关于Sal B对胆固醇流出影响的研究较少,本研究以PMA诱导THP-1源性巨噬细胞为研究对象,检测Sal B对胆固醇流出的影响。在蛋白和-nRNA水平测定THP-1源性巨噬细胞ABCA1表达,及PPAR-γ和LXRa蛋白水平的表达。采用PPAR-γ和LXRa激动剂及拮抗剂检测Sal B诱导的促进脂质外排过程中的作用,从而澄清Sal B与胆固醇流出的关系及其可能的作用机制。研究方法1.THP-1源性巨噬细胞的培养：人THP-1单核细胞在160nmol/ml PMA作用72h,诱导THP-1细胞分化生成巨噬细胞。2.THP-1源性巨噬细胞在50mg/L ox-LDL和1.0μCi/ml [3H]-胆固醇作用24h,诱导生成负载胆固醇的巨噬细胞。3. Sal B (0,0.1,1 and 10μM)作用于荷脂的THP-1源性巨噬细胞24h,及10μM Sal B作用于细胞0、3、6、12、24 h。液体闪烁法测定放射性物质进出细胞,评价Sal B对胆固醇流出的影响。4. Sal B作用于THP-1源性巨噬细胞,Real-time PCR方法检测ABCA1 mRNA水平的表达；Western blot方法检测ABCA1蛋白水平的变化。5.Sal B作用于THP-1源性巨噬细胞,Western blot方法检测PPAR-γ和LXRα蛋白水平的表达。6. PPAR-γ和LXRα激动剂及拮抗剂分别与Sal B共同作用于THP-1源性泡沫细胞24h, Real-time PCR方法检测ABCA1 mRNA水平的表达；Western blot方法检测ABCA1蛋白水平的变化。7. PPAR-γ和LXRa激动剂及拮抗剂分别与Sal B共同作用于荷脂THP-1源性巨噬细胞24h,测定胆固醇流出率。研究结果1. Sal B对负载胆固醇THP-1源性巨噬细胞胆固醇流出率的影响：在ApoA-I, HDL2或HDL3存在情况下,用不同浓度的Sal B (0,0.1,1 and 10μM)处理荷脂的THP-1源性巨噬细胞24h。与对照组比,1μM Sal B能促进胆固醇流出至ApoA Ⅰ和HDL2 (P<0.05),10μM Sal B促进胆固醇流出至ApoAⅠ和HDL2约是对照组2.5倍和3.2倍(P<0.01)。同时,10μM Sal B也能促进胆固醇流出至HDL3 (P<0.05)。10μM Sal B处理负载胆固醇的THP-1源性巨噬细胞0、3、6、12、24 h。结果显示,6h之内Sal B不能发挥对胆固醇流出至三种介质的作用；12h后Sal B明显增强胆固醇流出(P<0.05),培养24h后可显著增强胆固醇流出至ApoA Ⅰ和HDL2(P<0.01)。以上结果表明Sal B以浓度和时间依赖模式促进THP-1源性巨噬细胞胆固醇外排至ApoA Ⅰ、HDL2和HDL3。2.Sal B对THP-1源性巨噬细胞ABCA1在蛋白和mRNA水平表达的影响：不同浓度的Sal B (0,0.1,1 and 10μM)处理THP-1源性巨噬细胞24h。与对照组比较,0.1μM Sal B处理THP-1源性巨噬细胞后ABCA1蛋白和mRNA水平表达无明显改变,而1μM(P<0.05)和10μM(P<0.01)Sal B处理后,ABCA1蛋白和mRNA水平表达均明显提高。用10μM Sal B处理THP-1巨噬细胞0、3、6、12、24 h。结果显示,与对照组比较,10μM Sal B处理3h和6h对ABCA1蛋白水平表达无明显影响(P>0.05). 10μM Sal B刺激12h和24h ABCA1蛋白水平表达明显升高(P<0.01)。ABCA1 mRNA水平表达在10μM Sal B处理达6h后明显升高(P<0.01)。上述结果表明,Sal B可以浓度和时间依赖模式增强THP-1巨噬细胞ABCA1在蛋白水平和mRNA水平的表达。3. Sal B对THP-1源性巨噬细胞PPAR-γ和LXRa在蛋白水平表达的影响：不同浓度的Sal B (0,0.1,1 and 10μM处理THP-1源性巨噬细胞24h。与对照组比较,1μM和10μM Sal B处理后PPAR-γ和LXRa的表达显著增加(P<0.01); 0.1μM Sal B处理后PPAR-γ和LXRα的表达无明显改变(P>0.05)。4. PPAR-γ和LXRa激动剂及拮抗剂对Sal B诱导THP-1源性巨噬细胞ABCA1表达的影响：PPAR-γ拮抗剂GW9662和LXRa拮抗剂GGPP (20μM)均显著抑制Sal B诱导的ABCA1在蛋白和mRNA水平的表达(P<0.01),而PPAR-y激动剂罗格列酮(1μM)和LXRa激动剂GW3965 (5μM)大大增强ABCA1在蛋白和mRNA水平的表达(P<0.01)。5. PPAR-γ和LXRa激动剂及拮抗剂对Sal B诱导荷脂的THP-1源性巨噬细胞胆固醇流出的影响：PPAR-γ和LXRα激动剂及拮抗剂分别与Sal B共同孵育负载胆固醇的THP-1源性巨噬细胞24h。与对照组比较,Sal B显著促进胆固醇流出至ApoA I (P<0.01)、HDL2(P<0.01)和HDL3 (P<0.05)。PPAR-γ拮抗剂 GW9662和LXRα拮抗剂GGPP均明显抑制Sal B诱导的胆固醇流出(P<0.01)。PPAR-γ激动剂罗格列酮和LXRβ激动剂GW3965均明显增强Sal B诱导胆固醇流向ApoA I、HDL2和HDL3 (P<0.01)。结论1. Sal B可以时间和浓度依赖模式促进体外培养的负载胆固醇的THP-1源性巨噬细胞胆固醇流出。2. Sal B可以浓度和时间依赖模式增强THP-1巨噬细胞ABCA1在蛋白水平和mRNA水平的表达。3. Sal B促进THP-1源性巨噬细胞ABCA1表达是通过PPAR-γ和LXRa途径。4. Sal B诱导负载胆固醇的THP-1源性巨噬细胞胆固醇的流出是通过ABCA1/PPAR-γ/LXRa途径。