疟疾是一种以按蚊为传播媒介的传染性寄生虫病，在全球多个国家流行，发病率高，不但严重威胁人类健康，也给世界经济带来沉重的负担。近年来，疟原虫对抗疟药物、按蚊对杀虫剂逐渐产生了抗药性，给疟疾的治疗带来了重重阻碍。因此，研制安全有效的疟疾疫苗就成为控制疟疾的重要手段和迫切需要。　　 疟原虫的生活史复杂，分为多个阶段，每个阶段都有其特异性抗原，给疫苗的研制工作带来了很大困难。传统疫苗不可避免地存在着一些缺陷，再加上疟原虫具有抗原多态性和抗原变异等特点，致使到目前为止，大部分疟疾疫苗对动物或人进行免疫后，免疫效果不是很理想。而核酸疫苗具有制备简单、便于储存、免疫效果好、比较安全等传统疫苗无法比拟的优点。另外，反向疫苗学的出现为疫苗的研制提供了一条新的途径。与传统疫苗学相比，它不仅提高了候选疫苗筛选的成功率，而且还有助于预测和发现以往未知的各种抗原，因此受到越来越多研究者的重视。反向疫苗学已经在一些病原菌疫苗的研究方面得到了广泛的应用。　　 SAP1（sporozoite asparagine-rich protein1）在子孢子阶段特异性表达，它的主要功能是参与UIS(upregulated in infectious sporozoites)基因的转录后调控过程，后者对肝阶段早期疟原虫的发育发挥重要作用。研究表明，SAP1基因敲除的子孢子能正常侵入宿主肝细胞，但是在肝阶段早期发育就完全停滞。这些研究提示，SAP1具有成为红前期疫苗候选抗原的潜力。MSP1(merozoite surface protein1)是较为重要的红内期疫苗候选抗原，它在裂殖子入侵红细胞的过程中发挥重要作用。MSP1在疟原虫的发育过程中经过两次加工，裂解成若干片段，其中仅C末端的19 kDa片段随裂殖子进入红细胞。鉴于MSP1-19在疟原虫入侵红细胞的过程中发挥重要作用，该抗原作为最具有潜力的红内期候选抗原，受到越来越多研究者的关注。MAP2(mitogen-activated protein kinase2)是公认的雄配子体蛋白激酶，在雄配子体的分化过程中发挥重要作用。敲除恶性疟原虫MAP2基因可能并不影响雄配子体形成，但雄配子形成却完全受到抑制。这些研究提示，MAP2蛋白具有成为传播阻断疫苗候选抗原的潜力。　　 本研究应用生物信息学软件对约氏疟原虫红前期SAP1抗原进行预测分析，从中筛选出所需的目的基因，构建真核表达载体pcDNA3.1(+)/SAP1并对其免疫活性、安全性及保护性进行评估，以期筛选出一种有效的红前期疫苗候选抗原。然后进一步构建含有SAP1、MSP1和MAP2三种不同阶段抗原成分的约氏疟原虫多重阻断疫苗并检测其免疫活性，以期为拮抗疟原虫的基因多态性及抗原变异，开发安全有效的疟疾疫苗提供新思路。　　 方法：　　 一、P.yoelii17XL SAP1抗原的预测分析和基因扩增　　 （一）P.yoelii17XL SAP1抗原的预测分析　　 应用抗原决定簇预测软件 Predicting Antigenic Peptides（http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl）和蛋白跨膜区域预测软件TMHMMServer v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)并结合文献报道对P.yoelii17XL SAP1抗原进行预测分析，确定目的基因片段。　　 （二）P.yoelii17XL基因组DNA的提取　　 小鼠腹腔感染1×106P.yoelii17XL寄生的红细胞，每日监测外周血红细胞感染情况，当疟原虫血症较重时，取小鼠眼球血，提取疟原虫基因组DNA。　　 （三）SAP1截短基因的扩增　　 以疟原虫基因组DNA为模板，设计特异性引物，重叠PCR方法扩增SAP1截短基因。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶回收试剂盒回收目的片段。　　 二、真核表达载体pcDNA3.1(+)/SAP1的构建及瞬时表达　　 （一）真核表达载体pcDNA3.1(+)/SAP1的构建　　 双酶切SAP1截短基因和pcDNA3.1(+)质粒，回收SAP1基因和开环的pcDNA3.1(+)，将二者连接，构建真核表达载体pcDNA3.1(+)/SAP1。转化，铺板，筛选，酶切鉴定，测序。　　 （二）真核表达载体pcDNA3.1(+)/SAP1的瞬时表达　　 将双启动子三基因真核表达载体转染单层COS-7细胞。按照常规方法进行间接免疫荧光检测，一抗为1∶40稀释的抗SAP1小鼠多克隆免疫血清，二抗为1∶2000稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG抗体。抗SAP1小鼠多克隆免疫血清由SAP1重组蛋白免疫小鼠后获得。　　 （三）Western blot检测　　 将转染后的细胞用RIPA裂解液裂解，离心后取上清液进行10％ SDS-PAGE电泳，按照常规方法进行Western blot检测，一抗为1∶40稀释的抗SAP1小鼠多克隆免疫血清，二抗为1∶2000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体。　　 三、pcDNA3.1(+)/SAP1的免疫活性检测　　 （一）动物免疫　　 雌性BALB/c小鼠150只，随机分为3组，每组各50只。前两组分别在小鼠后肢股四头肌注射质粒pcDNA3.1(+)/SAP1和pcDNA3.1(+)，质粒浓度为1.0μg/μl，注射体积为100μl;第3组注射100μl的PBS。实验动物每隔三周加强免疫一次，共免疫3次。　　 （二）总IgG及其亚类水平检测　　 在每次免疫后两周，收集各组小鼠血清，用ELISA方法检测血清中总IgG水平。最后一次免疫后两周，收集血清，检测IgG1和IgG2a水平。　　 （三）细胞因子水平检测　　 在每次免疫后两周，无菌取各组小鼠脾脏，按照常规方法制备脾细胞培养上清液。用ELISA方法检测脾细胞培养上清液中IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10水平。　　 四、pcDNA3.1(+)/SAP1的组织分布及安全性检测　　 （一）样品采集和基因组提取　　 最后一次免疫后第1d、7d、30d、60d、90d，分别取各组小鼠血液、心脏、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏和注射部位肌肉，提取各组织基因组DNA。　　 （二）组织分布检测　　 设计两对引物，覆盖了质粒pcDNA3.1(+)/SAP1中SAP1基因的前、后两部分。用PCR方法检测质粒pcDNA3.1(+)/SAP1的组织分布情况。　　 （三）安全性检测　　 以1％琼脂糖凝胶电泳纯化后的小鼠基因组DNA为模板，按照上述组织分布检测的反应条件及引物进行PCR扩增，1％琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA是否与小鼠基因组DNA发生整合。　　 五、pcDNA3.1(+)/SAP1的保护性检测　　 （一）蚊攻击实验　　 最后一次免疫后两周，分别对疫苗组和正常对照组小鼠进行蚊攻击实验。按蚊在攻击前14-17d吸食含有P.yoelii17XL成熟配子体的血液，每只小鼠被5-8只按蚊叮咬攻击。　　 （二）肝脏虫荷检测　　 攻击后24h，分别取疫苗组和对照组小鼠肝脏，提取肝组织总RNA。同时选取未被攻击的正常小鼠的肝组织总RNA作为基准。以各组小鼠肝组织总RNA作为模板，根据疟原虫18S rRNA和小鼠GAPDH设计特异性引物，进行Real TimePCR检测。　　 （三）疟原虫血症水平检测和生存率统计　　 从攻击后第3d开始每天经小鼠尾静脉采血，制备薄血膜，Giemsa染色，镜检计数红细胞感染率，统计小鼠生存率。　　 六、P.yoelii17XL SAP1、MAP1和MAP2抗原的预测分析和基因扩增　　 （一）P.yoelii17XL SAP1、MAP1和MAP2抗原的预测分析　　 同方法一（一）。　　 （二）P.yoelii17XL基因组DNA的提取　　 同方法一（二）。　　 （三）SAP1-MSP1复合基因、MSP1和MAP2截短基因的扩增　　 以疟原虫基因组DNA为模板，设计特异性引物，重叠PCR方法扩增SAP1-MAP1复合基因、MSP1和MAP2截短基因。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶回收试剂盒回收目的片段。　　 七、双启动子三基因真核表达载体的构建及瞬时表达　　 （一）单质粒单启动子表达载体的构建　　 双酶切SAP1-MAP1复合基因和pETBlue2-T7-promoter质粒，回收SAP1-MAP1基因和开环的pETBlue2-T7-promoter，将二者连接，构建单质粒单启动子表达载体pETBlue2-T7-promoter-SAP1-MSP1。转化，铺板，筛选，酶切鉴定，测序。　　 双酶切MSP1、MAP2截短基因和pcDNA3.1(+)质粒，回收MSP1、MAP2基因和开环的pcDNA3.1(+)，将MSP1和MAP2基因分别与pcDNA3.1(+)连接，构建单质粒单启动子表达载体pcDNA3.1(+)/MSP1和pcDNA3.1(+)/MAP2。转化，铺板，筛选，酶切鉴定，测序。　　 （二）单质粒双启动子三基因真核表达载体的构建　　 双酶切pETBlue2-T7-promoter-SAP1-MSP1和pcDNA3.1(+)/MAP2质粒，回收其中带有目的基因的片段，将二者连接，构建单质粒双启动子三基因真核表达载体。转化，铺板，筛选，酶切鉴定。　　 （三）双启动子三基因真核表达载体的瞬时表达　　 将双启动子三基因真核表达载体转染单层COS-7细胞。按照常规方法进行间接免疫荧光检测，一抗分别为1∶40、1∶80和1∶40稀释的抗SAP1、MSP1和MAP2小鼠多克隆免疫血清，二抗为1∶2000稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG抗体。抗SAP1、MSP1和MAP2小鼠多克隆免疫血清分别由SAP1、MSP1和MAP2重组蛋白免疫小鼠后获得。　　 (四)Western blot检测　　 同方法二（三）。　　 八、多重阻断疫苗的免疫活性检测　　 （一）动物免疫　　 雌性BALB/c小鼠45只，随机分为3组，每组各15只。前两组分别在小鼠后肢股四头肌注射质粒双启动子三基因真核表达载体、pcDNA3.1(+)/SAP1、pcDNA3.1(+)/MSP1、pcDNA3.1(+)/MAP2和pcDNA3.1(+)，质粒浓度为1.0μg/μl，注射体积为100μl;第3组注射100μl的PBS。实验动物每隔三周加强免疫一次，共免疫3次。　　 （二）总IgG及其亚类水平检测　　 同方法三（二）。　　 （三）细胞因子水平检测　　 同方法三（三）。　　 九、统计学分析　　 应用SPSS16.0统计软件对实验数据进行统计分析，组间比较采用两样本t检验，所有数值以均数±标准差（(X)±SD）表示，P＜0.05表示差异有统计学意义。　　 结果：　　 一、P.yoelii17XL SAP1抗原的预测分析及基因扩增　　 （一）P.yoelii17XL SAP1抗原的预测分析　　 根据抗原决定簇和跨膜区域预测结果并结合文献报道，选择9288-9504位核苷酸序列（基因片段大小为216 bp）和9645-9962位核苷酸序列（基因片段大小为318 bp）进行研究，9505-9644位核苷酸序列为非编码区。　　 （二）SAP1截短基因的扩增　　 在216bp片段的3’端和318 bp片段的5’端分别加上Linker序列，用重叠PCR方法将这两个小片段连接成一个较大的SAP1片段作为目的基因（两端含有限制性酶切位点和免疫刺激序列CpG）。1％琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，PCR产物为564 bp，与预期结果相符。　　 二、真核表达载体pcDNA3.1(+)/SAP1的鉴定及瞬时表达　　 （一）真核表达载体pcDNA3.1(+)/SAP1的鉴定　　 真核表达载体pcDNA3.1(+)/SAP1的大小约为5.9kb，用HindⅢ和PstⅠ双酶切后产生两个片段，分别为4.0 kb和1.9 kb，与预期结果相符。质粒pcDNA3.1(+)/SAP1的测序结果与GenBank公布序列一致。　　 （二）瞬时表达　　 间接免疫荧光检测真核表达载体pcDNA3.1(+)/SAP1可在COS-7细胞中瞬时表达。Western blot结果显示，表达产物为22 kD大小的蛋白，与预期蛋白大小一致。　　 三、SAP1基因片段的免疫活性检测　　 pcDNA3.1(+)/SAP1组小鼠血清总IgG抗体及IgG亚类IgG1和IgG2a水平均显著高于对照组(P＜0.01)，且IgG2a水平高于IgG1。pcDNA3.1(+)/SAP1组小鼠细胞因子IFN-γ、 IL-2、IL-4和IL-10水平均显著高于对照组(P＜0.01)。　　 四、pcDNA3.1(+)/SAP1的组织分布及安全性检测　　 接种初期质粒DNA分布于所有组织中，接种后第60d质粒DNA只存在于注射部位肌肉中，而接种后第90d所有组织中都检测不到质粒DNA。纯化的各组织基因组DNA的PCR扩增结果显示，免疫后各时间段小鼠基因组均未检测到SAP1目的基因。　　 五、pcDNA3.1(+)/SAP1的保护性检测　　 （一）肝脏虫荷检测　　 感染P.yoelii17XL子孢子的按蚊攻击后24h，pcDNA3.1(+)/SAP1组小鼠的肝脏虫荷显著低于PBS组(P＜0.01)。　　 （二）原虫血症水平检测和生存率统计　　 疟原虫血症结果显示，P.yoelii17XL子孢子攻击后第3d，所有(10/10) PBS组小鼠出现疟原虫血症，第7d达到峰值65.7％。攻击后第3d，60％(6/10)pcDNA3.1(+)/SAP1组小鼠出现疟原虫血症，第9d达到峰值44.9％。攻击后第14d，80％(8/10) pcDNA3.1(+)/SAP1组小鼠出现原虫血症，而所有(10/10) PBS组小鼠均出现疟原虫血症。生存率结果显示，至攻击后第19d，pcDNA3.1(+)/SAP1组有3只小鼠存活，而PBS组小鼠在攻击后9天内全部死亡。　　 六、P.yoelii17XL SAP1、MSP1和MAP2抗原的预测分析及基因扩增　　 （一）P.yoelii17XL SAP1、MSP1和MAP2抗原的预测分析　　 根据抗原决定簇和跨膜区域预测结果并结合文献报道，选择MSP1的4855-5238位核苷酸序列(基因片段大小为384 bp)和MAP2的391-1542位核苷酸序列（基因片段大小为1155 bp）进行研究。SAP1蛋白的分析结果见结果四。　　 （二）SAP1-MSP1复合基因和MAP2截短基因的扩增　　 在SAP1片段的3’端和MSP1片段的5’端分别加上Linker序列，用重叠PCR方法将这两个小片段连接成一个较大的SAP1-MSP1复合基因片段（两端含有限制性酶切位点和免疫刺激序列CpG）。1％琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，SAP1-MSP1复合基因的PCR产物为963 bp，MSP1截短基因的PCR产物为402 bp，MAP2截短基因的PCR产物为1170bp，与预期结果相符。SAP1-MSP1复合基因和MAP2截短基因的测序结果与GenBank公布序列一致。　　 七、真核表达载体的鉴定及瞬时表达　　 （一）真核表达载体的鉴定　　 真核表达载体pcDNA3.1(+)/MSP1的大小约为5.8kb，用HindⅢ和PstⅠ双酶切后产生两个片段，分别为4.0 kb和1.8 kb，与预期结果相符;真核表达载体pcDNA3.1(+)/MAP2的大小约为6.5 kb，用HindⅢ和PstⅠ双酶切后产生三个片段，分别为4.0 kb、1.5 kb和1.0kb，与预期结果相符;双启动子三基因真核表达载体的大小约为8.3 kb，用HindⅢ酶切后产生三个片段，分别为5.3 kb、2.0kb和1.0kb，与预期结果相符。　　 （二）瞬时表达　　 间接免疫荧光检测双启动子三基因真核表达载体可在COS-7细胞中瞬时表达。Western blot结果显示，表达产物为22 kD、14kD和45 kD大小的蛋白，与预期蛋白大小一致。　　 八、双启动子三基因真核表达载体的免疫活性检测　　 疫苗组小鼠血清总IgG抗体及IgG亚类IgG1和IgG2a水平均显著高于各个对照组(P＜0.05)，且IgG2a水平高于IgG1。疫苗组小鼠Th1型细胞因子IFN-γ和IL-2水平显著高于各个对照组(P＜0.01)，Th2型细胞因子IL-4和IL-10水平显著高于各个对照组(P＜0.05)。　　 结论：　　 1、成功构建了含有SAP1截短基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/SAP1，该真核表达载体可以在哺乳动物细胞中瞬时表达。　　 2、pcDNA3.1(+)/SAP1可以诱导体液和细胞免疫应答，具有良好的免疫活性。　　 3、质粒pcDNA3.1(+)/SAP1在小鼠组织内的持续分布达60d以上，未发现质粒DNA整合到小鼠基因组DNA中，pcDNA3.1(+)/SAP1具有良好的安全性。　　 4、pcDNA3.1(+)/SAP1对P.yoelii17XL子孢子的感染具有一定的保护作用。　　 5、成功构建了约氏疟原虫多重阻断疫苗，该疫苗可以在哺乳动物细胞中瞬时表达。　　 6、多重阻断疫苗可以诱导体液和细胞免疫应答，具有良好的免疫活性。　　 7、与单一抗原成分的疫苗相比，多重阻断疫苗的免疫活性更好。