CTCF(CCCTC-binding factor，CCCTC结合因子)是广泛存在于真核生物的多功能转录因子。其M段11个锌指结构可以形成不同的组合，使CTCF调控多种靶基因的表达。目前已发现它可以抑制c-myc基因的表达，增强app基因的启动子活性，调控H19／Igf2的imprinting，作为鸡溶菌酶基因的沉默子成分，作为鸡β球蛋白等多个基因结构域的绝缘子成份，以及作为X染色体失活的候选蛋白等，所以CTCF在细胞生长与增殖、系统发生以及肿瘤发生等方面都有着重要的作用。人们通过对这些单个基因的研究对CTCF的功能有了较广泛的认识，但CTCF是细胞生长增殖和系统发生的调控网络的中心环节，它的变化会导致细胞内的一系列改变。本课题旨在利用小干涉RNA(small interfering RNA，siRNA)抑制CTCF在体细胞中的表达，进而研究CTCF改变所致调控网络的整体性变化，全面揭示CTCF功能。目前国内外还没有类似的研究报道，国外仅有一篇利用长双链RNA干涉技术在卵细胞中抑制CTCF表达从而影响H19基因imprinting的报道，与我们的研究有很多不同，因此我们的研究具有一定的创新性。本课题首先用RT-PCR．技术从人宫颈癌细胞系HeLa细胞总RNA中克隆了CTCF全长cDNA，在大肠杆菌BL21(DE3) 中分段表达了CTCF蛋白N段和M段。对CTCF蛋白N段进行了镍柱亲和纯化，得到的产物纯度大于80％：对CTCF蛋白M段进行了在柱复性和变性镍柱亲和纯化研究。用纯化后的CTCF蛋白N段免疫家兔，获得CTCF的多克隆抗体，进而用免疫印迹法亲和纯化抗体并用于细胞内CTCF蛋白的检测，纯化后的抗体特异性大大提高。本课题随后用两种siRNA干涉技术首次成功抑制了CTCF在体细胞中的表达。先用体外转录的siRNA分别在293FT和HeLa细胞系中抑制CTCF的表达，这些细胞系都表现出了CTCF mRNA和蛋白水平下降以及细胞生长抑制。其后用核酸内切酶制备的siRNA(endoribonuclease-prepared siRNA，esiRNA)使CTCF基因在HeLa细胞系中的表达被抑制70％以上，其mRNA和蛋白水平显著下降并表现出强烈的细胞生长抑制。在上述两种研究中，CTCF mRNA下降幅度、蛋白下降中文摘要幅度与细胞生长抑制程度之间具有明显的相关性，提示CTCF正常表达对细胞生长的重要性。 本课题还利用细胞瞬时表达实验在HeLa细胞系中证明:CTCF蛋白N段单独作用对腺病毒晚期主要启动子的转录激活活性比完整蛋白强，CTCF的转录激活结构域主要在该蛋白N段，而M段和C段几乎没有转录激活活性。 本课题为整体性地研究CTCF基因抑制后相关表达谱的改变提供了重要的实验依据和必要的技术支持。