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背景视网膜母细胞瘤（retinoblastoma,RB）是儿童眼部最常见的恶性肿瘤,全球发病率约为1:15000,占儿童恶性肿瘤的3%。由于缺乏早期诊断和有效的治疗方法,大部分视网膜母细胞瘤患儿预后都比较差,这种情况在发展中国家尤为明显。视网膜母细胞瘤不是一个儿童常见肿瘤,但其仍严重威胁患儿的视力及生命。虽然目前临床上视网膜母细胞瘤的治疗技术不断发展,出现了诸如:眼球摘除、眼球肿瘤局部治疗（冷冻疗法,光凝疗法,经瞳孔温热疗法）、放化疗等手段,但视网膜细胞瘤患者总体生存率至今仍未明显改善。目前对视网膜母细胞瘤的发病机制仍然知之甚少,随着现代细胞分子生物学的发展,研究已表明视网膜母细胞瘤的发生发展多与分子及信号通路的异常有关。因此寻找一个有效的、特异性的分子生物标记/治疗靶点将给视网膜母细胞的诊断和治疗带来新的希望。长链非编码RNA（Long noncoding RNAs,LncRNAs）是长度超过200个核苷酸（nucleotide,nt）的RNA,不具有蛋白编码功能,近来研究发现LncRNA在调控细胞增殖、细胞周期、细胞分化、细胞凋亡等多种生理和病理过程中发挥重要的生物学功能。大量实验研究表明在多种肿瘤中都发现LncRNA的异常表达,且这些表达失调的LncRNA主要与肿瘤的发生、发展、转移浸润及复发等病理过程有密切关系,提示LncRNA在肿瘤的发生发展过程中可能起到促癌或抑癌的作用,或可作为肿瘤新型特异性生物标记,给肿瘤的诊断及治疗带来新的希望。目前,LncRNA在视网膜母细胞瘤中的研究相对较少,但已有研究显示LncRNA在视网膜母细胞瘤的发生发展中具有非常重要的生物学功能,将来或可作为视网膜母细胞瘤早期诊断与治疗的靶点。本研究选择LncRNA UCA1作为研究对象,采用定量PCR技术检测视网膜母细胞瘤组织及癌旁正常组织和细胞系中LncRNA UCA1的表达;应用RNA干扰技术沉默视网膜母细胞瘤Y79,Weri-Rb1细胞中LncRNA UCA1的表达,同时观察LncRNA UCA1基因沉默对RB细胞增殖凋亡的影响,并进一步研究LncRNA UCA1/miR-124/c-myc信号通路轴对RB发生、发展的调控作用,期望通过本研究丰富RB的机制研究,为诊断和治疗提供理论依据。第一部分LncRNA UCA1对人视网膜母细胞瘤细胞增殖和凋亡的影响研究目的明确LncRNA UCA1在视网膜母细胞瘤中的表达情况及其生物学功能。研究方法1、Real-time PCR检测视网膜母细胞瘤组织及细胞系Y79细胞、Weri-Rb1细胞中LncRNA UCA1的表达水平。2、设计并合成3条针对LncRNA UCA1的干扰序列用以敲除LncRNA UCA1及1条阴性对照序列,将慢病毒作为转染载体包含以上序列。将含有干扰LncRNA UCA1表达的慢病毒（sh-UCA1）及阴性对照（sh-NC）转染Y79细胞和Weri-Rb1细胞,并通过嘌呤霉素筛选稳转细胞,之后Real-time PCR检测Y79和Weri-Rb1细胞中LncRNA UCA1表达水平,筛选出敲除效率最佳的靶序列sh-RNA,应用于后续实验;3、在Y79细胞、Weri-Rb1细胞中成功敲除LncRNA UCA1后,CCK-8检测细胞增殖能力;Transwell实验检测细胞侵袭和转移能力;流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡,并检测细胞凋亡关键因子Bcl-2、Bax表达水平及caspase-3活性水平;裸鼠皮下成瘤实验体从体内验证敲除LncRNA UCA1后肿瘤的生长情况。结果1.利用Real-time PCR方法确认LncRNA UCA1在视网膜母细胞瘤系Y79细胞、Weri-Rb1细胞中高表达,与正常对照细胞人视网膜色素上皮细胞ARPE-19细胞存在显著统计学差异。2、成功构建了3条针对LncRNA UCA1的特异性RNA干扰序列sh-UCA1-1、sh-UCA1-2、sh-UCA1-3及阴性对照sh-NC,并以慢病毒为载体进行转染,转染Y79和Weri-Rb1细胞后嘌呤霉素筛选出稳转细胞,Real-time PCR检测结果显示,与对照组相比,三组sh RNA转染细胞中LncRNA UCA1表达水平均下降,且差异具有统计学意义（P＜0.01）。与sh-UCA1-1、sh-UCA1-3组相比,sh-UCA1-2的敲除效果最高。因此选择sh-UCA1-2用于进行后续实验。3.干扰LncRNA UCA1的表达水平抑制Y79细胞、Weri-Rb1细胞增殖能力以及抑制细胞的迁移及侵袭能力。4.干扰LncRNA UCA1的表达水平可促进促凋亡因子Bax的表达,抑制凋亡抑制相关基因Bcl-2的表达,并增加caspase-3活性表达水平,从而通过促进视网膜母细胞瘤细胞凋亡从而抑制其增殖。5.干扰LncRNA UCA1的表达后G0/G1期细胞显著增多,而S期细胞显著降低,即细胞周期发生停滞。6.干扰LncRNA UCA1的表达可显著抑制裸鼠皮下移植瘤的生长。结论LncRNA UCA1在视网膜母细胞瘤组织及细胞系（Y79,Weri-Rb1）中高表达。敲低LncRNA UCA1的表达可抑制视网膜母细胞瘤细胞增殖、迁徙及转移能力,并促进视网膜母细胞瘤细胞凋亡,同时使细胞周期发生停滞。动物实验证实敲低LncRNA UCA1的表达可抑制裸鼠皮下移植瘤的生长。第二部分LncRNA UCA1调控人视网膜母细胞瘤细胞增殖、迁移与侵袭及凋亡的分子机制研究研究目的明确LncRNA UCA1基因是否通过miR-124/c-myc通路对人视网膜母细胞瘤细胞Y79、Weri-Rb1的增殖、迁移侵袭及凋亡能力发挥调控作用。研究方法1.首先利用Real-time PCR方法检测视网膜母细胞瘤组织及细胞系Y79、Weri-Rb1细胞中miR-124、c-myc的表达水平。2.采用Real-time PCR、Western Blot方法检测干扰LncRNA UCA1表达对Y79细胞、Weri-Rb1细胞中miR-124及c-myc表达的影响3.miR-124抑制剂（miR-124 inhibitor）转染细胞构建miR-124低表达的Y79、Weri-Rb1细胞。采用CCK8实验,Transwell实验,流式细胞检测技术分别检测干扰LncRNA UCA1表达后的Y79、Weri-Rb1细胞共转染miR-124 inhibitor后对细胞增殖、迁移和侵袭及凋亡作用的影响;4.采用双荧光素酶检测技术、Real-time PCR方法、Western Blot实验分析miR-124与c-myc两者在Y79、Weri-Rb1细胞中的关系。5.c-myc过表达（pc DNA-c-myc）质粒转染细胞构建c-myc过表达的Y79、Weri-Rb1细胞。采用CCK8实验,Transwell实验,流式细胞检测技术分别检测干扰LncRNA UCA1表达的Y79、Weri-Rb1细胞共转染pc DNA-c-myc后增殖、迁移和侵袭及凋亡作用的影响;结果1.Real-time PCR检测显示miR-124在视网膜母细胞瘤组织及细胞系Y79、Weri-Rb1细胞中低表达,c-myc在视网膜母细胞瘤组织及细胞系Y79、Weri-Rb1细胞中高表达,与正常对照细胞人视网膜色素上皮细胞ARPE-19相比存在显著统计学差异（P＜0.05）。2.Real-time PCR方法显示干扰LncRNA UCA1表达后,视网膜母细胞瘤系Y79、Weri-Rb1细胞中miR-124表达显著增加（P＜0.05）,而增强或抑制miR-124的表达后,LncRNA UCA1的表达降低或增加,LncRNA UCA1靶向作用于miR-124,且两者之间呈负性相关关系。另外,干扰LncRNA UCA1表达后,视网膜母细胞瘤系Y79、Weri-Rb1细胞中c-myc表达显著降低,与空白转染组相比存在显著统计学差异（P＜0.05）。3.CCK8实验、Transwell实验、流式技术检测结果表明与单独转染沉默LncRNA UCA1质粒组相比,共转染miR-124 inhibitor质粒后,由于沉默LncRNA UCA1所降低的细胞增殖、迁移和侵袭能力以及增加的细胞凋亡得到逆转（P＜0.05）。4.Real-time PCR及Western Blot实验显示LncRNA UCA1沉默明显降低了Y79、Weri-Rb1细胞中c-myc的蛋白水平,而共转染miR-124inhibitor后重新增加了由沉默LncRNA UCA1引起的c-myc蛋白水平下降（P＜0.05）。c-myc是miR-124的靶蛋白,双荧光素酶检测实验结果表明同时转染miR-124 mimic和c-myc-WT报告基因质粒,荧光素酶强度显著下降（P＜0.05）。5.CCK8实验、Transwell实验及流式技术检测结果显示与单独转染沉默LncRNA UCA1质粒组相比,共转染pc DNA-c-myc质粒后,c-myc表达增加,并且由于沉默LncRNA UCA1所降低的细胞增殖、迁移和侵袭能力以及凋亡的增加均发生逆转（P＜0.05）。结论1.干扰LncRNA UCA1表达能够提高miR-124在Y79和Weri-Rb1细胞中的表达水平,降低c-myc2.miR-124是LncRNA UCA1的靶基因,且两者之间负性调控表达。抑制miR-124的表达能够逆转LncRNA UCA1沉默对Y79和Weri-Rb1细胞增殖,凋亡,迁移和侵袭的影响3.c-myc是miR-124的靶蛋白,与miR-124呈负性调控4.过表达c-myc能逆转LncRNA UCA1沉默对Y79和Weri-Rb1细胞增殖,凋亡,迁移和侵袭的影响5.LncRNA UCA1通过抑制miR-124促进c-myc的表达来促进视网膜母细胞瘤的进展