肠道沙门菌鸡血清型鸡白痢生物型(Salmonella enterica serovar Gallinarum biovar Pullorum)(以下简称鸡白痢沙门菌)是引起鸡白痢病(pullorum disease,PD)的病原菌,它特异性地感染禽类,可经卵垂直传播,对雏鸡和幼禽致死率极高,严重危害禽养殖业。鸡白痢病曾在世界范围内广泛流行,得益于家禽改良计划,鸡白痢病已经在欧美许多发达国家的商业化家禽中被清除,而在世界其他区域鸡白痢病仍很常见。在中国,鸡白痢病疫情波及范围广泛,阳性检出率居高不下,菌株耐药性逐年升高。快速准确地鉴定病原菌并对其分型是疫病监测和爆发调查的关键。鸡白痢沙门菌无鞭毛且不运动,血清分型无法将其和鸡伤寒沙门菌(S.enterica serovar Gallinarum biovar Gallinarum)区分,因为两者拥有相同的血清抗原式1,9,12:-:-。虽然两者生化表型存在差异,但没有单一可靠生化指标能将两者完全区分。鸡白痢沙门菌分离株存在高度遗传同质性,目前的分子分型方法分辨率有限,难以对分离株进行区分,这使得常规的沙门菌监测方法在鸡白痢病的应用中受到制约。近年来,新一代测序(next-generation sequencing,NGS)技术迅猛发展,使得测序通量不断提升,成本直线下降。在此契机下,细菌全基因组测序(whole-genome sequencing,WGS)成为了流行病学研究的可行性应用。WGS能够实现快速准确的物种鉴定,推断药物敏感性和毒力,以及提供高分辨率的分型。本研究对1962-2014年间在4个国家分离到的97株鸡白痢沙门菌进行全基因组测序。基于核心基因组单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)位点,重建了鸡白痢沙门菌种群演化模型。利用贝叶斯分析推测了鸡白痢沙门菌的突变速率、分化时间和传播历史。通过识别假基因和基因缺失,评估了鸡白痢沙门菌基因组退化程度和趋势,并推测受影响的代谢通路和毒力特征。对基因组中存在的可移动遗传元件(mobile genetic elements,MGEs)进行鉴定,发现了鸡白痢沙门菌耐药性的遗传机制。1.细菌分离株基因组序列分析管线BIGSAP的建立及其在鸡白痢病监测中的应用随着NGS技术的日趋成熟,基因组测序应用于流行病学监测的瓶颈已转向对数据的处理和分析。为此,我们构建了细菌分离株基因组序列分析管线(Bacteria Isolate Genome Sequence Analysis Pipeline,BIGSAP),它整合了多个数据库和生物信息学工具,实现“一站式”的细菌基因组数据分析,包括测序数据质量控制、基因组组装、物种鉴定、血清型鉴定、分子分型和药物敏感性预测等。它能够将传统微生物实验室需要一周甚至数周才能完整的任务压缩至1小时以内。使用BIGSAP无需实验人员具有相应的生物信息背景,并且结果简单易读,能够满足监测的一般需求。通过BIGSAP分析,我们核实了 97株鸡白痢沙门菌分离株的物种和血清型。识别出8个获得性耐药基因:aadA5、blaTEM1B、dfrA17、strA、strB、sul1、sul2和tet(A),以及1个基因突变:gyrA(Ser83Phe)。这些耐药基因和突变介导细菌对6类抗生素的耐药性:磺胺类、β内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、二氨基密啶类和氟喹诺酮类药物。鉴定出9个ST型,除已报道的ST92、ST2151、ST2453以外,还发现6个新的ST型:ST3717、ST3720、ST3721、ST3722、ST3723和ST3727。所有ST型只有一个或两个位点差异,属于同一个eBurstGroup,即 eBG4。2.鸡白痢沙门菌系统发育分析揭示鸡白痢病1100年传播历史常规的分子分型方法分辨率有限,难以对鸡白痢沙门菌分离株进行有效区分。在本研究中,我们以鸡白痢沙门菌RKS5078基因组作为参考,在排除重复、缺失和重组区域后,获得4,160,759 bp的核心基因组,基于读序比对的方法,从中识别出6,795个SNP位点。基于核心基因组SNPs的分型方法提供了超常的分辨率,它几乎可以对任意两株分离株进行区分。随后,我们利用最大似然法和贝叶斯法对鸡白痢沙门菌种群进行系统发育分析。我们推断,鸡白痢沙门菌的最早共同祖先(most recent common ancestor,MRCA)出现于公元914年(95%CI 565-1273),距今约1,100年,估计突变速率为0.80个SNPs/基因组/年,或者1.92 × 10-7个碱基替换/位点/年。现存的鸡白痢沙门菌可分为四个确定的谱系(lineages),我们将其命名为LⅠ-LⅣ。LⅠ、LⅡ和LⅢ都是中国本土的谱系,LⅢ在1837年(CI95%1782-1889)传入欧洲;LⅣ可能起源于美洲,于1842年(CI95%1778-1902)传入欧洲。传播事件发生的时间与19世纪中期席卷欧洲和美国的“母鸡热(hen fever)”相吻合,当时中国的本土鸡被作为观赏鸟类运往英国和美国,我们据此推断殖民贸易促进了鸡白痢沙门菌在洲际间的传播。3.持续退化的鸡白痢沙门菌基因组:假基因和基因缺失基因组退化是沙门菌宿主适应性形成的普遍机制。我们的研究发现,鸡白痢沙门菌基因组经历了广泛的退化,并且这种退化的趋势仍在持续。我们共发现552个假基因和55个缺失变异,这些变异可能导致660个基因失活。平均每株分离株拥有167个失活基因,其中有122个失活基因是所有鸡白痢沙门菌所共有的。这意味着,约有73%的失活突变在鸡白痢MRCA中已经存在,并通过垂直转移遗传给子代。基因失活在MRCA分化以后并没有停止,平均每株菌株积累了 45个失活基因,平均每年失活0.041个基因。85%的基因失活是由假基因导致的,只有少部分是由缺失变异导致的。鞭毛和菌毛可以介导对宿主细胞的黏附和侵入,并且可以激活模式识别受体,鸡白痢沙门菌丢失鞭毛和菌毛相关基因可能是病原菌避免非特异性炎性刺激的机制。鞭毛基因flhB和flgK在鸡白痢和鸡伤寒分化之前就已经失活,这可能是运动性丧失的直接因素。在LⅠ、LⅡ和LⅢ中,srfABC操纵子出现不同程度的退化,它编码2类鞭毛基因,受到FlhDC的调控。鸡白痢沙门菌MRCA独立失活了 7个菌毛基因:bcfE、stfC、pegCD、steB、lpfE和sefC。LⅢ中的缺失突变导致stfA和fimAI发生截短。基因失活会影响病原体在外部环境中和宿主体内的存活能力,这可能和鸡白痢沙门菌从肠道到系统性生存方式的改变相关。在鸡白痢沙门菌的MRCA中,有8条代谢通路失活,包括血红素合成(hemF)、糖异生(ppsA)、海藻糖合成(treZ)、L-亮氨酸合成(ilvI)、L-异亮氨酸合成(leuD)、4-氨基丁酸合成(gabT)、丙酮酸合成(gpmB)以及尿囊素降解(allD)。多个与物质摄取与分泌相关的转运系统受影响,如硫酸盐和硫代硫酸盐的摄取(cysU)、谷氨酸天冬氨酸的摄取(gltL)、组氨酸转位(hisJ)以及甜菜碱摄取(proW和osmV)等。甜菜碱是一种渗透压保护剂,无法摄取甜菜碱导致细菌难以维持胞内的渗透压,这可能是鸡白痢沙门菌对化学和机械压力的抵抗力明显较弱的原因之一。此外,鸡白痢沙门菌MRCA中torAC和torR失活,导致其可能无法利用N-氧化三甲胺进行厌氧呼吸。4.可移动遗传元件介导鸡白痢沙门菌的毒力和耐药性沙门菌基因组的可塑性得益于侧向基因转移(lateral gene transfer,LGT),这些获得性基因赋予沙门菌独特的生态和致病特性。我们在鸡白痢基因组中鉴定出丰富的可移动遗传元件(mobile genetic elements,MGEs),它们是LGT的载体,包括4个原噬菌体,3个小质粒,以及5个耐药质粒。原噬菌体显示出谱系特异性。其中φSPUl是P22样原噬菌体,我们从中发现一个可能的分泌的效应蛋白基因,命名为pipB3。其推定蛋白PipB3包含多个串联的五肽重复基序,与PipB/PipB2存在相似性。PipB/PipB2是沙门菌三型分泌系统的效应蛋白,能够改变宿主细胞的生理功能,促进细菌在宿主组织中存活。φSPU1特异性地存在于中国,尤其是中国中东部的分离株中。(φSPU1与ST104高度相似,后者是鼠伤寒沙门菌DT104所共有的原噬菌体。小质粒相对保守,存在于大多数分离株中。pSPUS1编码毒力基因ipaJ,可能来源于弗氏志贺菌(Shigella flexneri)的侵袭质粒。IpaJSF的C端具有与C39样蛋白酶同源的结构域,其能够切割N-肉豆蔻酰化蛋白,进而影响细胞生长、信号传导、自噬体成熟和细胞器功能。IpaJSPU的C端拥有保守的模体(motif)结构,包括三个与IpaJSF一致的起催化作用的氨基酸残基Cys64、His206和Asp218,这意味着IpaJSPU可能发挥着与IpaJSF相似的功能。大质粒介导的获得性耐药是鸡白痢沙门菌多重耐药性(multi-drugresistance,MDR)产生的主要因素。5个耐药质粒涉及3个不相容群IncX、IncN和IncQ。所有的耐药分支都存在于中国优势谱系LⅠ中,这从侧面反映抗生素过度使用情况在我国普遍存在。多重耐药性的快速增长发生于约1990年以后,晚于各耐药分支的MRCA出现的时间。这说明,耐药菌株早已经存在,而在近20年其种群规模出现显著增长,这可能要归因于禽养殖业抗生素的过度使用。IncX1质粒pSPUR1和IncN质粒pSPUR3潜在危害最大,因为它们分别编码VirB/D4和Trw型T4SS。T4SS是一个多功能性的分泌系统,可通过接合作用,将耐药质粒水平转移给其他受体菌。此外,T4SS还被发现与毒力相关,可能赋予鸡白痢沙门菌更强的致病性,甚至改变其宿主适应性。