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林麝作为国家一级保护动物,林麝的人工养殖一直受肺炎制约。在四川某林麝养殖场曾爆发肺炎,死亡率极高。本课题组从死亡林麝肺脏分离出1株肺炎克雷伯氏菌,命名为LPKP。将LPKP与实验室保存的1株林麝肠源肺炎克雷伯氏菌致病菌株GPKP进行了小鼠致病性和全基因组序列对比分析,并对GPKP基因组中的新基因kp05372进行生物信息学分析和原核表达载体构建。主要研究内容和实验结果如下:1.林麝肺源肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定及致病性分析结合生化试验和分子生物学鉴定,死亡林麝肺脏分离菌为肺炎克雷伯氏菌,命名为LPKP。将LPKP与另一株实验室保存的林麝肠源肺炎克雷伯氏菌致病菌株GPKP进行小鼠致病性和荚膜分析。两株菌都能够引起小鼠死亡,剖检可见肝脏、肺脏肿大等病理变化。LPKP对小鼠半数致死量(LD50)为4.1×10~9 CFU/mL,GPKP对小鼠LD50为6.3×107CFU/mL,病理组织切片分析两菌株均能够引起小鼠肺、肝、肾发生病理变化,而GPKP还能够引起小鼠空肠发生病理损伤。印度墨汁染色显示两菌株菌体四周有一层透明的荚膜带。2.两株肺炎克雷伯氏菌的全基因组测序分析全基因组测序分析结果显示,LPKP基因组大小为4,736,259 bp,包含5,516个开放阅读框(Open Reading Frame,ORF),GPKP基因组大小为4,879,707 bp,包含5,490个ORF。进化分析发现,LPKP与K.pneumoniae KP-1同属于一个分支,GPKP与K.pneumoniae YH43同属于一个分支;MLST分析发现,LPKP序列类型为ST29,GPKP序列类型未知;wzi和wzc基因型分型方法不能对GPKP荚膜进行分型,而LPKP荚膜型为K54型;荚膜基因簇结构分析表明,LPKP荚膜基因簇包含20个基因,且同一K54型荚膜基因簇高度保守。而GPKP荚膜基因簇包含24个基因,荚膜相关基因manCB存在于GPKP荚膜基因簇的3’端,这与其它79个已知荚膜基因簇均不相同。该分析结果与PCR扩增结果相符;特有基因分析显示,GPKP基因组中共有840个特有基因,功能分析表明其中有5个基因与细菌的毒力相关,参与编码了RfbU、FbpC、FbpB、FbpA和IrgA等毒力蛋白。3.新基因kp05372原核表达载体构建基于GPKP全基因组序列注释分析,筛选到一个新基因kp05372,上传到Genbank数据库,获得登录号为KX026659。kp05372基因包含909个碱基序列,编码产物由302个氨基酸组成,无信号肽,是一种不稳定的、在细胞内发挥生理作用的脂溶蛋白?其结构域N端为保守的螺旋-转角-螺旋结构(helix-turn-helix,HTH),C端为Lys R底物结合的调控结构域,启动子分析显示其启动子区域具有正反双向启动子和非典型的-10盒和-35盒等特性。生物信息学分析表明KP05372是一个典型的Lys R型转录调控因子(LysR-type transcriptional regulator,LTTR)。将kp05372基因连接原核表达载体p ET-32(a)中,获得重组表达质粒p ET-32(a)/kp05372,转入表达菌株BL21(DE3)中。经SDS-PAGE和Western-blotting分析,最佳表达条件为37℃,0.6 mmol/LIPTG诱导表达6 h,融合蛋白分子量约为53.2 k D。综上所述,本研究成功地从林麝肺脏中分离出一株致病性肺炎克雷伯氏菌LPKP,LPKP对小鼠LD50大于肠道分离株GPKP。GPKP基因组特有的毒力相关基因以及特有的荚膜型可能是导致其特有致病表型的重要原因。同时,新LTTR kp05372的生物信息学分析及原核表达载体构建,为该基因的功能研究奠定了基础。