背景与目的:肝纤维化是慢性肝病恶性进展的关键环节,临床研究表明,扶正化瘀能够有效改善肝组织炎症和肝纤维化。肝内巨噬细胞（由肝固有巨噬细胞-Kupffer细胞和外周来源巨噬细胞组成）在肝纤维化的形成和逆转中扮演了重要的角色,已有研究显示扶正化瘀方可通过调控Kupffer细胞（KCs）旁分泌抑制肝星状细胞活化,但其抗肝纤维化过程中对肝内巨噬细胞表型极化的调控尚未有深入系统研究。本课题主要探讨扶正化瘀方通过调控肝内巨噬细胞表型极化从而抗肝纤维化的分子机制。方法:1、研究扶正化瘀方对肝纤维化小鼠肝内巨噬细胞表型极化的影响雄性C57BL/6小鼠随机分为正常组、模型组和扶正化瘀方给药组。采用15%CCl_4,2ml/kg腹腔注射诱导小鼠肝纤维化模型,每周三次,共造模6周。同时给予扶正化瘀方灌胃治疗,给药剂量为5.6g/kg,给药体积为0.2ml,每天灌胃。正常组和模型组灌胃等体积生理盐水,正常组小鼠腹腔注射等量橄榄油。6周后处理小鼠,观察并记录小鼠一般情况（体重、肝重、脾重）;检测小鼠血清肝功能AST、ALT;HE染色、天狼猩红染色和羟脯胺酸含量等评价扶正化瘀方的抗炎抗肝纤维化药效。通过门静脉灌流分离正常组、模型组和扶正化瘀方给药组小鼠肝内巨噬细胞,流式分析肝内巨噬细胞中肝固有巨噬细胞-KCs（CD45⁺F4/80⁺CD11B^-）和外周来源巨噬细胞（CD45⁺F4/80⁺CD11B⁺）比例变化;肝固有巨噬细胞中CD86⁺促炎型巨噬细胞（M1型）和CD206⁺抑炎型巨噬细胞（M2型）比例变化和外周来源巨噬细胞中Ly6C^high促炎型巨噬细胞（M1型）和Ly6C^low抑炎型巨噬细胞（M2型）比例变化。2、研究扶正化瘀方调控肝内巨噬细胞极化的作用机制分离正常组、模型组和扶正化瘀方给药组中小鼠肝内巨噬细胞,贴壁培养20min后去除其他非实质肝细胞;Trizol法提取RNA,逆转录后进行实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测巨噬细胞中趋化因子CCL₂、CX₃CR₁、CX₃CL₁的表达。探讨扶正化瘀方调节肝内巨噬细胞表型极化的作用机制。3、研究扶正化瘀方对巨噬细胞M1/M2表型的调节采用1μg/ml脂多糖（LPS）激活RAW264.7细胞诱导M1促炎性巨噬细胞;10ng/ml IL-4刺激诱导M2抑炎性巨噬细胞,随后加入不同浓度扶正化瘀方进行干预,Griess试剂检测细胞NO的分泌;PCR检测i NOS、TNF-α、CCL₂、CX₃CR₁、IL-10、Arg1、CD206等m RNA的表达,探讨FZHY对M1/M2巨噬细胞表型的影响。4、研究扶正化瘀方对M1型巨噬细胞促进肝星状细胞活化的影响扶正化瘀方干预LPS诱导的M1型巨噬细胞培养24小时后,去除细胞上清,加入新的培养基培养24小时。随后将培养上清加入预先贴壁培养的JS1小鼠肝星状细胞中,并用TGF-β作为阳性对照药,通过免疫荧光检测JS1中α-SMA的表达评价JS1的活化程度。结果:1、扶正化瘀方能显著减轻小鼠肝组织炎症、减轻肝纤维化。与正常组小鼠相比,模型组小鼠血清中AST、ALT以及Hyp明显升高;HE染色中可见大量炎性细胞浸润,肝细胞损伤;天狼猩红提示肝组织内大量胶原纤维增生沉积。与模型组相比,扶正化瘀方组小鼠血清转氨酶水平显著降低,肝脏炎症得到明显缓解,胶原纤维变细甚至消失。2、扶正化瘀方能够显著降低肝内巨噬细胞中外周来源巨噬细胞（CD45⁺F4/80⁺CD11B⁺）的浸润的同时,显著降低外周来源巨噬细胞中Ly6C^high M1促炎型巨噬细胞(CD45⁺F4/80⁺CD11B⁺Ly6C^high)的比例,增加Ly6C^low M2抑炎型巨噬细胞(CD45⁺F4/80⁺CD11B⁺Ly6C^low)的比例。同时,肝内巨噬细胞中肝固有巨噬细胞-KCs（CD45⁺F4/80⁺CD11B^-）的流式结果表明:扶正化瘀方对肝纤维化小鼠中KCs的数量无显著影响,但是能显著降低KCs中CD86⁺M1促炎型KCs比例,增加CD206⁺M2抑炎型KCs的比例。3、扶正化瘀方能够显著促进肝组织和肝内巨噬细胞（KCs和外周来源巨噬细胞）中趋化因子CX₃CL₁的生成和基因表达,同时显著抑制趋化因子受体CX₃CR₁、趋化因子CCL₂基因的表达。4、扶正化瘀方能显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞（M1型）中炎症介质NO的表达和M1型巨噬细胞基因标志物i NOS、CCL₂m RNA的表达;上调IL-4诱导的RAW264.7细胞（M2型）中M2型巨噬细胞标志物IL-10、CD206、Arg1的表达。同时,我们实验中还发现,扶正化瘀方能促进M1型巨噬细胞中CX₃CR₁、IL-10、Arg1等M2型巨噬细胞相关标志物的表达。5、扶正化瘀方能显著降低LPS诱导的M1型巨噬细胞上清与JS1（小鼠肝星状细胞）细胞共培养后α-SMA的表达。结论:1、扶正化瘀方能显著改善CCl₄小鼠肝脏炎症和纤维化程度。2、扶正化瘀方能降低M1型,促进M2型KCs的比例。通过降低肝内M1型KCs中CCL₂的表达抑制外周来源促炎的Ly6C^highM1型巨噬细胞浸润,同时通过增加趋化因子CX₃CL₁/CX₃CR₁表达促进外周促炎的Ly6C^highM1型巨噬细胞向抑炎的Ly6C^lowM2表型极化,从而起到防治CCl₄小鼠肝纤维化的药理效应。3、扶正化瘀方能抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞向促炎的M1型活化并促进其从M1型向抑炎的M2型极化;同时,扶正化瘀方能促进IL-4诱导RAW264.7巨噬细胞向抑炎的M2型活化。4、扶正化瘀方能显著降低M1型巨噬细胞对肝星状细胞的活化作用。