免疫促凋亡分子是将免疫分子与促凋亡分子进行融合表达的新型蛋白。课题组前期，经过对免疫促凋亡分子各个组成结构域不断探索和改构，构建并表达出了靶向HER2阳性肿瘤细胞的免疫促凋亡分子e23sFv-Fc-Fdt-tBid。该分子单链抗体结构域能够识别并结合肿瘤细胞表面的HER2分子，诱导细胞将免疫促凋亡分子内吞入细胞内吞体中；Fc结构域起到提高融合蛋白表达水平、增强免疫促凋亡分子杀伤功效的作用，并且为免疫促凋亡分子有效纯化提供了便利；Fdt连接肽的功能是在免疫促凋亡分子被内吞入靶细胞后，在内吞体酸性条件下，特异性的被内吞体中furin蛋白酶切割，Fdt在断裂后，可以释放携带的杀伤分子tBid，这是免疫促凋亡策略的核心部分；tBid是杀伤效果最显著的促凋亡分子，在靶细胞中释放后，可以起到诱导细胞色素c从线粒体泄漏到胞浆，从而对细胞产生杀伤作用。　　本课题的研究目标是将前期构建的免疫促凋亡分子e23sFv-Fc-Fdt-tBid的单链抗体结构域更换为靶向EGFR分子的单链抗体L31sFv。L31sFv单链抗体序列是前期课题组根据EGFR单抗Nimotuzunab的轻、重链可变区，而设计、合成的。将L31sFv经过优化后，构建免疫促凋亡分子L31sFv-Fc-Fdt-tBid，扩展免疫促凋亡分子策略在EGFR阳性细胞的应用，同时优化免疫促凋亡分子表达条件，以及寻找增加蛋白稳定性的方法。其次将表达免疫促凋亡分子的细胞株进行优化，验证其对融合蛋白的表达效果，并用来增强抗肿瘤免疫促凋亡分子表达水平。最后尝试借助病毒载体将表达免疫促凋亡分子的基因感染进入NK92细胞，验证NK92细胞对免疫促凋亡分子L31sFv-Fc-Fdt-tBid的表达水平和分泌效果，以及验证NK92细胞分泌的免疫促凋亡分子在体内的抗肿瘤活性。　　我们成功构建含免疫促凋亡分子L31sFv-Fc-Fdt-tBid的表达载体，在293F细胞的培养上清中，得到了目的蛋白，蛋白大小72KDa，与预期一致。经过功能学验证，证实了免疫促凋亡分子L31sFv-Fc-Fdt-tBid对EGFR阳性的肺癌细胞具有靶向杀伤作用。为了进一步提高目的蛋白的分泌表达水平，我们将免疫促凋亡分子的信号肽进行了替换，对比不同的信号肽对融合蛋白分泌效果的影响，证实了胰岛素（Insulin）信号肽对免疫促凋亡分子分泌表达的效果最为理想。最后对免疫促凋亡分子的最适表达时间进行了的探索，在瞬转目的质粒后96h，免疫促凋亡分子分泌达到水平最高。　　在实验的进行中，我们观察到免疫促凋亡分子稳定性较差。当利用超滤管将含有免疫促凋亡分子的细胞表达上清进行离心浓缩后，目的蛋白含量在72KDa处未见增强，却在55KDa处出现新生蛋白条带。换用在透析袋中脱水浓缩的方法，免疫促凋亡分子能够被有效浓缩，但浓缩后的蛋白在经过滤器过滤除菌处理后，72KDa处目的条带完全降解，55KDa处的新生蛋白条带再次出现。为寻求目的蛋白降解的原因，我们将免疫促凋亡分子的Fdt序列进行突变，使该位置不能被furin蛋白酶切割。通过验证，表达出的融合蛋白可以用超滤管成功离心浓缩，浓缩后的蛋白大小符合预期，并且被滤器过滤处理后，不存在降解现象。为解决免疫促凋亡分子稳定性差的问题，我们参考3种可被Cathepsin B蛋白酶切割的连接肽序列、2种可被Cathepsin D蛋白酶切割的连接肽序列，同时也更换另外2种可被furin蛋白酶识别的结构序列，构建了免疫促凋亡分子L31sFv-Fc-B-tBid系列、L31sFv-Fc-D-tBid系列以及L31sFv-Fc-F-tBid系列。在用293F细胞进行表达时，L31sFv-Fc-B-tBid、L31sFv-Fc-D-tBid系列的融合蛋白，可以成功的在培养上清中得到全长表达。选取L31sFv-Fc-B-tBid系列中一个表达较好的蛋白进行超滤管浓缩，蛋白浓缩效果良好，无降解现象。将浓缩后的蛋白进行滤器处理，蛋白也无降解片段出现。　　为了解决免疫促凋亡分子在哺乳动物表达系统表达效率低的问题，我们尝试对293F细胞进行改造。构建了含VA RNA基因的表达质粒；通过与目的质粒的共转染，证实了VA RNA基因对目的蛋白表达水平具有明确的提高作用；用转座子piggyBac(PB)系统将VA RNA基因稳定的感染293F细胞，经过筛选，成功构建了可稳定表达VA RNA基因的细胞株293F-VA；经过表达验证，证实了293F-VA细胞株较亲本细胞293F，对免疫促凋亡分子e23-Fc-Fdt-tBid的胞内表达和分泌水平均具有明显的提高作用。　　为了更好的将免疫促凋亡分子应用到体内实验中，我们尝试利用NK92细胞作为表达免疫促凋亡分子的载体细胞。我们先后利用携带绿色荧光蛋白（GFP）的腺病毒、腺相关病毒、不同包膜蛋白的逆转录病毒和慢病毒对NK92细胞进行感染，最终用ampho包膜蛋白的逆转录病毒和慢病毒成功感染NK92细胞，流式细胞仪检测感染效率分别为20%和60%。我们构建了含促凋亡分子L31sFv-Fc-Fdt-tBid基因的慢病毒载体，用嘌呤霉素对感染病毒的NK92细胞进行筛选，连续传代培养后，用Western Blot检测，证实了NK92细胞内成功表达出免疫促凋亡分子L31sFv-Fc-Fdt-tBid；用ELISA检测，证实了培养上清中，含有与EGFR抗原特异结合的分泌蛋白。将培养上清与EGFR阳性肺癌细胞共孵育后，证实了培养上清中含有靶向杀伤EGFR阳性肺癌细胞的免疫促凋亡分子。　　综上所述，1、免疫促凋亡分子L31sFv-Fc-Fdt-tBid在293F细胞中能够以全长的形式分泌到细胞上清中；2、293F细胞的培养上清对EGFR阳性肺癌细胞具有明确的靶向杀伤作用；3、经过对信号肽的替换，可以使免疫促凋亡分子在293F细胞表达后分泌量明显提高；4、经过对Fdt连接肽的替换，免疫促凋亡分子L31sFv-Fc-B-tBid和L31sFv-Fc-D-tBid在293F中能够以全长的形式分泌到细胞上清中，在长时间离心浓缩和过滤除菌操作后，避免了出现蛋白降解的现象；5、成功构建高效表达蛋白细胞株293F-VA，该细胞株可以将免疫促凋亡分子的表达量和分泌量明显提高；6、成功的探索出将外源基因感染NK92细胞的方法，利用慢病毒载体将免疫促凋亡分子L31sFv-Fc-Fdt-tBid基因成功感染NK92细胞；7、证实了免疫促凋亡分子L31sFv-Fc-Fdt-tBid能够在NK92细胞内表达并有效分泌；8、稳定表达免疫促凋亡分子的NK92细胞系的培养上清液，对EGFR阳性的肺癌细胞具有明确的靶向杀伤效果。因此本实验为利用NK细胞表达外源基因提供了方法和思路，探索完成了免疫促凋亡分子在体内运用的新策略。