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目的:我室以往的研究已证实,甲醛炎性痛引起的伤害性信息传入可诱导脊髓血红素氧合酶-1(Heme oxygenase -1,HO-1)表达增多,脊髓内HO-1表达增多以及内源性一氧化碳(Carbon monoxide,CO)产生增多在痛感觉和痛觉过敏产生中发挥重要作用。但甲醛炎性痛引起的伤害性信息传入诱导的脊髓HO-1表达增多的机制尚未见相关报道。已有大量的研究资料表明,外周组织炎性痛引起伤害性信息传入脊髓,可引起初级神经元释放大量的以兴奋性氨基酸(excitatory amino acids,EAAs)为主的神经递质,其作用于脊髓二级神经元受体,引起细胞内信号转导分子一氧化氮(nitric oxide, NO)产生增加和蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)激活,这些改变均参与痛感知及痛过敏的形成过程。在我室以往的研究中,曾观察了鞘内注射N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid,NMDA)受体拮抗剂MK-801或PKC抑制剂CH对甲醛炎性痛诱导的脊髓NOS表达和NO产生的影响,发现二者均可抑制甲醛炎性痛诱导的脊髓NOS表达和NO的产生,证明甲醛炎性痛时脊髓后角NO的产生,除受NMDA受体激活状态调控以外,也受胞内信号转导分子PKC的调控。目前已证明,NOS/NO和HO/CO两个系统之间存在着密切的联系。大鼠甲醛炎性痛时脊髓内HO-1表达增多是否也与NMDA受体激活以及胞内信号转导分子PKC活化有关,尚有待进一步研究加以证实。本实验通过观察甲醛炎性痛大鼠鞘给予NMDA受体拮抗剂MK-801以及PKC选择性抑制剂灯盏花素乙(chelerythrine chloride ,CH)及正常大鼠鞘内内给予NMDA受体选择性激动剂NMDA以及PKC激动剂佛泼醇脂(Phorbol 12-Myrstate-Acetate ,PMA),观察二者对甲醛炎性痛大鼠以及正常大鼠脊髓HO-1表达的影响,探讨甲醛炎性痛诱导的大鼠脊髓HO-1蛋白表达改变是否受NMDA受体激活以及PKC活化状态调控,探讨甲醛炎性痛大鼠脊髓HO-1蛋白表达增加的机制。1 NMDA受体激活在甲醛炎性痛诱导脊髓HO-1蛋白表达中的作用方法:雄性Sprague-Dawley大鼠35只,体重280±20g,由河北医科大学实验动物中心提供。将大鼠随机分为5组,分别为:①对照组(Control),②甲醛组(FM),③甲醛+生理盐水组(FM+NS),④甲醛+MK-801组(FM+MK-801)。⑤NMDA组,每组7只动物,Control组不加任何处理,直接断头取脊髓。FM组大鼠于右后掌皮下注射5%甲醛溶液0.2ml,于注射甲醛后24h断头取材。FM+NS和FM+MK-801组大鼠分别预先鞘内注射NS或NMDA受体抑制剂MK-801溶液,15 min后于右后掌皮下注射甲醛溶液0.2m1,于注射甲醛后24h断头取材。NMDA组为正常大鼠鞘内注射NMDA受体激动剂NMDA溶液,于鞘内注射后24h时断头取材。采用免疫组织化学方法观察脊髓HO-1蛋白表达。结果发现,Control组大鼠L5节段双侧脊髓后角Ⅰ-Ⅱ板层HO-1阳性细胞较少,多呈菱形,一些为圆形或卵圆形,部分细胞可见明显的突起及细长的神经纤维,这些细胞符合神经元的形态特征。与Control组相比,FM组双侧脊髓后角Ⅰ-Ⅱ板层HO-1阳性细胞的数目明显增加(P<0.01 ),并且这些阳性细胞的染色深度亦明显增加(P<0.01 ),表明甲醛炎性痛可诱导脊髓后角HO-1表达增加。FM+NS组和FM组两组相比无显著性差异,表明鞘内注射溶剂NS对HO-1表达无明显影响。与FM组比较,FM+MK-801组大鼠双侧脊髓后角Ⅰ-Ⅱ板层HO-1阳性细胞的数目明显减少(P<0.01),并且这些阳性细胞的染色深度亦明显降低(P<0.01) ;表明阻断NMDA受体,可以明显抑制甲醛炎性痛诱导的脊髓后角HO-1蛋白的表达。与Control组相比,正常大鼠鞘内注射NMDA溶液后,动物出现了烦躁不安,舔咬物品,抓盒底,自发退缩等伤害性感受行为。同时大鼠双侧脊髓后角Ⅰ-Ⅱ板层HO-1阳性细胞的数目明显增多(P<0.01 ),并且HO-1阳性细胞染色深度明显增加,这一结果进一步证明,NMDA受体激活可促进脊髓神经元HO-1蛋白的表达。2蛋白激酶C活化对甲醛炎性痛诱导的脊髓HO-1蛋白表达的影响雄性Sprague-Dawley大鼠35只,体重280±20克,由河北医科大学实验动物中心提供。大鼠被随机分为5组:①对照组(Control),②甲醛组(FM),③甲醛+二甲基亚砜组(FM+DMSO),④甲醛+CH组(FM+ CH)。⑤PMA组,每组7只动物。对照组不加任何处理,直接断头取材。FM组大鼠于右后掌皮下注射5%甲醛溶液0.2m1,于注射甲醛后24h断头取材。FM+ DMSO组和FM+ CH组动物于注射甲醛前15min,鞘内分别注射10%二甲基亚砜溶液(DMSO,为CH和PMA溶剂)或10nmol CH,注射甲醛后24h断头取材;PMA组为正常大鼠,首先鞘内注射含有0.8nmo1的PKC激动剂PMA溶液,于鞘内注射后24h时断头取材。采用免疫组织化学方法观察脊髓后角Ⅰ-Ⅱ板层HO-1蛋白表达。结果发现,与Control组相比,FM组和FM+DMSO组大鼠L5节段两侧脊髓后角Ⅰ-Ⅱ板层内HO-1阳性细胞数目明显增加,且染色明显加深(P <0.01),而FM组和FM+DMSO组两组相比无显著性差异(P>0.05),说明鞘内注射二甲基亚砜溶液对HO-1表达无明显影响。与FM组比较,FM+CH组大鼠脊髓后角Ⅰ-Ⅱ板层内HO-1阳性细胞的数目明显减少,阳性细胞染色明显变浅(P <0.01),但仍高于Control组水平。表明抑制PKC活化可以抑制甲醛炎性痛诱导的HO-1蛋白表达增加。正常大鼠鞘内注射PMA后,动物出现了烦躁不安,舔咬物品,抓盒底,自发退缩等伤害性感受行为。同时脊髓神经元HO-1蛋白表达发生明显改变。与Control组相比,PMA组大鼠L5节段脊髓后角Ⅰ-Ⅱ板层内HO-1阳性细胞数目明显增多(P<0.01),阳性细胞平均光密度明显增加(P<0.05),表明染色明显加深。这一结果进一步证实,PKC激活可促进脊髓神经元HO-1蛋白的表达。结论:鞘内注射NMDA受体拮抗剂MK-801可以抑制甲醛炎性痛诱导的HO-1蛋白表达增加,正常大鼠鞘内注射NMDA受体激动剂NMDA可促进大鼠脊髓HO-1蛋白表达;表明甲醛炎性痛诱导的脊髓HO-1蛋白表达受NMDA受体调控。鞘内注射PKC抑制剂CH能抑制甲醛炎性痛诱导的大鼠脊髓HO-1蛋白表达,正常大鼠鞘内注射PKC激动剂PMA则可促进大鼠脊髓HO-1蛋白表达;表明甲醛炎性痛诱导的大鼠脊髓HO-1蛋白表达也受PKC活化状态调控。