研究背景心血管疾病(CVD)已经成为危害当今社会人类健康的主要疾病,动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)是最为常见的心血管疾病之一。动脉粥样硬化斑块是一种进展性的、易发生破裂的斑块,斑块的破裂以及血栓的形成会导致急性冠脉综合征(ACS)等心血管急性事件的发生。因此稳定斑块、防止斑块破裂,在临床治疗中具有十分重要的意义。动脉粥样硬化斑块主要由富含脂质的粥样物质和富含胶原的纤维帽组成,其中胶原纤维的含量与斑块稳定性密切相关。研究表明,增加斑块中胶原纤维的含量,可以稳定易损斑块,减少斑块的破裂,对于降低心血管急性事件的发生率有重要意义。脯氨酰-4-羧化酶(P4H)通过促进胶原蛋白三螺旋结构的形成,在合成胶原蛋白中发挥关键作用。存在于多种细胞和组织中的P4Hα1,是胶原合成中的限速酶,对胶原的成熟与分泌十分重要。褪黑素(MT)是一种吲哚类激素,具有多种生物学功能,包括抗炎、抗氧化、抗病毒、抗衰老、神经保护等。褪黑素受体在体内的广泛分布,决定了其治疗适应症的多样性。在一些心血管疾病中,褪黑素水平降低,提示褪黑素可能在心血管疾病进程中发挥作用。有研究表明,褪黑素可以通过PI3K/Akt信号通路减弱脓毒症引起的心功能障碍。我们最近的研究发现,褪黑素可以通过下调基质金属蛋白酶抑制血管紧张素Ⅱ诱发的腹主动脉瘤的发生与发展,但褪黑素在动脉粥样硬化斑块稳定性中的作用及其潜在的机制尚未有报道。转录因子Sp1是一种可以与许多启动子的富含GC序列结合的锌指转录因子,现已发现该基因有三种不同亚型的转录变体。以往研究表明Akt可以直接磷酸化Sp1,从而增加Sp1与靶基因启动子的结合,我们利用生物信息学预测,Sp1可能是调控P4Hα1的转录因子。Sp1参与多种细胞进程,包括细胞分化、生长、凋亡、免疫反应、染色质重构等。但是Sp1在动脉粥样硬化斑块稳定性中的作用及其潜在的机尚不清楚。在本实验中,我们研究了褪黑素在ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块稳定性中的作用并对其潜在作用机制进行了探讨。研究目的1.探究褪黑素对平滑肌细胞P4Hα1的影响;2.探究褪黑素调节P4Hα1的分子机制;3.探究褪黑素对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块稳定性的影响及其机制。研究方法1.细胞培养与刺激第一部分:将小鼠平滑肌细胞系(MOVAS)细胞分为对照组、褪黑素组,设置不同的时间和浓度梯度,选择最适宜刺激时间和浓度进行下一步实验。第二部分:将细胞分为对照组、褪黑素组、LY294002组、褪黑素+LY294002组。第三部分:将细胞分为对照组、褪黑素组、H89组、褪黑素+H89组。第四部分:将细胞分为对照组、褪黑素组、光辉霉素A(MTM)组、褪黑素+光辉霉素A组。收集细胞,进行下一步实验。2.动物模型的建立50只8周龄雄性ApoE-/-小鼠全程高脂饮食10周。高脂饮食第2周末时,行右颈总动脉套管植入术后随机分为五组:正常对照组(4%酒精溶液)、低剂量褪黑素组(0.3mg/kg/day)、中剂量褪黑素组(3mg/kg/day)、高剂量褪黑素组(30mg/kg/day)和褪黑素(30mg/kg/day)+光辉霉素A组(150μg/kg/day)(每组10只)。继续高脂饮食,直至第10周末,所有小鼠进行安乐死后取材。2.组织学及免疫组化染色右侧颈动脉组织经多聚甲醛固定,流水冲洗后包入OCT中,制备5μm的连续冰冻切片,对切片组织进行H&E染色、天狼猩红染色和油红O染色。通过免疫组织化学染色的方法检测颈动脉斑块组织内P4Hα1、平滑肌细胞(α-SMA)以及巨噬细胞(MOMA-2)的含量,使用Image-Pro Plus 6.0软件进行数据分析,计算斑块的易损指数。4.免疫印迹分析(Western blot)制备的细胞、组织蛋白经过凝胶电泳、转膜、牛奶封闭、相应的一抗二抗孵育、化学发光等步骤,对目标蛋白的表达量进行统计分析。5.实时荧光定量PCR(RT-PCR)收集细胞或组织,提取RNA,实时荧光定量技术检测目的mRNA表达。6.染色质免疫沉淀(ChIP)分析甲醛处理细胞使蛋白质与DNA交联,用超声波将染色质打断后利用相应抗体,使蛋白质-DNA交联复合体沉淀;解除交联后纯化DNA进行PCR,分析Sp1与P4Hα1启动子结合的能力。7.统计学分析本实验所有数据结果采用SPSS v23.0软件进行统计和分析,其中两组之间的比较运用t检验,多组间比较运用One-Way ANOVA检验,数据显示使用均数±标准差表示,P<0.05时认为有统计学意义。研究结果1.褪黑素增加平滑肌细胞中P4Hα1 mRNA和蛋白水平褪黑素刺激后可上调平滑肌细胞P4Hα1的mRNA水平,同时Western blot结果表明褪黑素刺激2小时后,平滑肌细胞P4Hα1蛋白水平明显升高,在10μmol/l褪黑素刺激8 h时,P4Hα1的表达水平达到高峰。2.褪黑素通过Akt/Sp1信号通路调控P4Hα1的表达Western blot结果表明,褪黑素刺激1小时后可显著上调平滑肌内p-Akt(Ser473)水平;Akt抑制剂LY294002可以在mRNA和蛋白质水平上抑制褪黑素诱导的P4Hα1表达。染色质免疫共沉淀实验结果证实Sp1可以与P4Hα1启动子结合,并且褪黑素可以促进二者的结合。Sp1的抑制剂MTM可以使P4Hα1表达降低。以上结果表明Sp1是P4Hα1的转录因子,褪黑素可以通过Akt/Sp1信号通路调控P4Hα1的表达。3.高剂量褪黑素增加ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的稳定性组织病理学染色结果显示,与对照组相比,低剂量和中剂量褪黑素对斑块内的脂质、胶原、平滑肌细胞、巨噬细胞的含量没有显著影响,而高剂量褪黑素可以显著降低斑块中的脂质与巨噬细胞的含量,同时可以增加平滑肌细胞、胶原纤维含量,降低斑块易损指数,从而增加其稳定性。4.褪黑素增加ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块中P4Hα1和胶原I的表达Western blot和免疫组织化学染色结果显示,高剂量褪黑素显著增加小鼠颈动脉斑块中P4Hα1的表达。Collagen I蛋白表达水平也显著增加。研究结论1.褪黑素可以上调P4Hα1的表达水平;2.高剂量褪黑素增加ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的稳定性;3.Sp1是P4Hα1的转录因子,褪黑素通过增加Akt介导的Sp1转录活性,促进其与P4Hα1的启动子结合,调控P4Hα1的表达,从而促进斑块中胶原纤维的合成。研究背景腹主动脉瘤(AAA)的特征是腹主动脉局部的永久性扩张,其扩张程度超过正常动脉直径的50%以上。在65岁以上的男性中,AAA的发病率高达9%,AAA破裂相关的死亡率高达80%。在美国,动脉瘤破裂是第20大死亡原因,每年有多达15000人死于AAA破裂。目前这种疾病还没有有效的药物治疗,唯一有效的方法是手术治疗。目前已明确的AAA危险因素包括年龄、性别、吸烟、动脉粥样硬化和家族史,但其发病的确切原因尚不清楚。在病理生理上,腹主动脉瘤表现为动脉壁各层的扩张,与炎症、血管平滑肌细胞凋亡和细胞外基质(ECM)破坏等相关,其中基质金属蛋白酶(MMPs)降解血管胶原蛋白和弹性蛋白等细胞外基质是动脉瘤形成的关键。在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的AAA动物模型中,MMPs的mRNA和蛋白水平升高,抑制MMPs可以减少腹主动脉瘤形成。与正常的主动脉壁相比,主动脉瘤患者的主动脉壁中MMPs水平升高。平滑肌细胞(SMCs)主要表达MMP-2,而MMP-2在AAA疾病进展过程中起着关键作用。尽管对于AAA中MMPs水平升高这一现象已经明确,但其具体的调控分子机制仍不明确。Sp1转录因子是具有高度保守性DNA结合域的Sp/KLF转录因子家族中的一员。研究发现,Sp1的调控十分严格,它的表达和活性除了受Sp1蛋白本身的磷酸化、泛素化等影响外,还受其它蛋白的调控。Sp1参与细胞的生长、分化等重要生命进程。在肿瘤中,Sp1可以通过调控与之相关的基因转录而促进肿瘤细胞生长和增殖。在某些人类肿瘤如星形胶质细胞瘤中,MMP-2的表达和细胞侵袭需要Sp1的参与,但在平滑肌中Sp1和MMP-2之间的关系尚未确定。肝激酶B1(LKB1)最早是在Peutz-Jeghers综合征(PJS)中发现的一种抑癌基因,它是一种在哺乳动物细胞中广泛表达的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。全身敲除LKB1的小鼠具有胚胎致死性,其中心血管的发育存在较大缺陷,这提示LKB1与心血管系统存在一定联系。内皮细胞中LKB1能够调控内皮一氧化氮合酶(eNOS)的活性,内皮特异性敲除LKB1可导致小鼠内皮功能障碍和高血压。此外,LKB1抑制血管内皮生长因子(VEGF)的表达和血管新生。在巨噬细胞中,LKB1通过抑制清道夫受体A(SRA)的表达和泡沫细胞的形成,从而抑制动脉粥样硬化的进程。然而,LKB1在AAA中的作用尚未有研究。本研究应用平滑肌特异性敲除LKB1的Ld1r-/-小鼠,皮下泵入AngⅡ,建立AAA动物模型以探讨LKB1在AAA中的作用。研究目的1.探究平滑肌特异性敲除LKB1对AAA发生发展的影响;2.探究LKB1敲除或过表达对MMP-2的影响;3.探究LKB1调控MMP-2表达和AAA的作用机制。研究方法1.动物模型的建立将 LKB1 flox/flox 小鼠与 SM22-CreERT2 小鼠杂交,产生 LKB1 flox/flox/Cre+小鼠,6周龄时连续腹腔注射他莫昔芬(1 mg/d)5天,产生LKB1SMKO小鼠。接受相同剂量他莫西芬的LKB1flox/flox/Cre-小鼠作为对照小鼠(CTR)。LKB1flox/flox/Cre+小鼠与 Ldlr-/-小鼠杂交产生 Ldlr-/-/LKB1flox/flox/Cre+小鼠,Ldlr-/-LKB1flox/flox/Cre+小鼠在他莫昔芬诱导后得到双敲小鼠(Ldlr-/-/LKB 1 SMKO),接受相同剂量他莫昔芬的 Ld1-/-/LKB1flox/flox/Cre-小鼠作为对照小鼠(Ld1r-/-LKB1flox/flox)。雄性 Ldlr-/-/LKB1 SMKO 和Ld1r-/-/LKB1flox/flox 小鼠通过微型渗透泵注入 AngⅡ(1000 ng/kg/min)28 天,建立小鼠AAA模型。造模期间,所有小鼠均为高脂饮食喂养。28天小鼠安乐死后,取所需标本。所有实验均按照山东大学伦理委员会的指导方针进行。2.细胞培养(1)原代小鼠平滑肌细胞的分离与培养本实验使用的原代小鼠血管平滑肌细胞提取自4-6周的小鼠主动脉,使用含有10%FBS的DMEM常规培养。(2)人主动脉平滑肌的培养使用SMCM常规培养。3.小鼠LKB1过表达腺病毒的制备LKB1过表达腺病毒与绿色荧光蛋白(GFP)对照病毒由汉恒生物科技有限公司包装合成,感染至血管平滑肌细胞中,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测其表达效率。4.血压检测采用小动物血压计测量各组小鼠鼠尾血压。5.组织病理学、免疫组织化学染色及免疫荧光取材后的小鼠腹主动脉组织用4%多聚甲醛进行浸泡24 h固定保存或放入冻存管中在-80℃冰箱保存。制备5 μm石蜡切片或5 μm的冰冻切片,用于H&E染色、VVG染色以及后续实验。前者可观察血管组织的大体形态,后者用于观察血管壁弹力板的断裂情况。应用免疫组织化学染色法,检测LKB1、MMP-2、CD68(巨噬细胞)、4-HNE(氧化应激)的表达水平。免疫荧光检测小鼠主动脉平滑肌中LKB1的敲除情况。6.DHE染色DHE可以被细胞或小鼠组织内的ROS氧化,产生红色荧光。根据红色荧光强度,可以判断ROS的多少和变化。7.蛋白质印迹实验(Western blot)提取小鼠腹主动脉组织或平滑肌细胞总蛋白,用Western blot法检测LKB1、Sp1、MMP-2、MMP-9、phospho-AMPKα、AMPKα、MCP-1、phospho-P65和P65的表达水平。8.实时荧光定量PCR(RT-PCR)应用RT-PCR技术测定动脉组织或平滑肌细胞中MMP-2、TNF-α和IL-6的mRNA表达水平。9.明胶酶谱检测MMPs活性应用明胶酶谱试剂盒检测检测的MMP-2的活性。10.免疫共沉淀(IP)应用免疫共沉淀技术检测Sp1与LKB1的结合情况。11.染色质免疫共沉淀实验(ChIP)染色质免疫共沉淀实验检测Sp1与MMP-2启动子片段的结合情况。12.荧光素酶报告基因检测构建野生型和Sp1结合位点突变的MMP-2启动子荧光素酶报告基因,检测LKB1对MMP-2启动子荧光素酶活性的影响。13.人体动脉瘤标本从接受开放性手术修复的AAA患者身上获得人的AAA标本,对照标本取自同一患者相邻的非动脉瘤性主动脉,免疫组化检测LKB1、MMP-2、α-SMA的表达。14.统计学分析所有统计学资料使用Prism 7.0软件分析处理。数据的正态性通过Shapiro-Wilk检验分析。统计差异采用单因素方差分析或双因素方差分析,之后做Bonferroni分析;两组比较采用t检验,多组间比较应用2-Way ANOVA;或采用非参数Mann-Whitney U检验分析两组间比较。生存资料采用Kaplan-Meier方法分析,log-rank检验比较组间差异。计量资料以均数土标准误表示。P<0.05认为差异有统计学意义。研究结果1.LKB1SMKO小鼠的构建血管组织的免疫荧光和Western blot结果显示在LKB1SMKO小鼠平滑肌中LKB1的表达显著低于对照小鼠。2.敲除LKB1可增加MMP-2的表达和活性,过表达LKB1降低MMP-2的表达和活性平滑肌特异性敲除LKB1后,可显著提高小鼠主动脉中MMP-2的mRNA水平及蛋白表达,同时增加MMP-2的活性,但MMP-9的表达没有显著变化,同时,LKB1过表达后,MMP-2的mRNA水平、蛋白水平以及活性明显低于GFP组。3.LKB1与Sp1结合,抑制MMP-2的表达免疫共沉淀结果显示LKB1可以和Sp1结合。染色质免疫共沉淀结果表明Sp1可以与MMP-2启动子结合,且过表达LKB1可以抑制二者的结合。荧光素酶报告基因检测显示突变Sp1结合位点消除了 LKB1介导的对MMP-2启动子的抑制作用。Sp1的抑制剂光辉霉素A(MTM)可显著降低VSMCs中MMP-2的表达。4.平滑肌特异性敲除LKB1促进了腹主动脉瘤的形成皮下泵入AngⅡ进行AAA造模小鼠中,Ld1r-/-/-/LKB1SMKO组小鼠的AAA发生率、瘤体最大直径、动脉瘤破裂导致的死亡率都显著高于Ld1r-/-/LKB 1flox/flox组。5.平滑肌特异性敲除LKB1增加了炎症和氧化应激Western blot检测结果表明与Control组相比,LKB1SMKO组小鼠主动脉中MCP-1、phospho-P65表达增加。RT-PCR结果表明LKB1SMKO组小鼠主动脉中TNF-α和IL-6的mRNA水平升高。DHE染色结果显示LKB1SMKO组小鼠主动脉中活性氧水平增加。而在LKB1过表达的VSMCs中,与GFP相比,炎症和活性氧水平都是减少的。免疫组化结果表明,与Ld1r-/-/LKB1flox/flox 组小鼠相比,Ld1r-/-/LKB1 SMKO小鼠 AAA 组织中的MMP-2、CD68 和 4-HNE 升高。6.LKB1在AAA组织中表达降低免疫组化结果显示人和小鼠AAA组织中LKB1的表达降低。研究结论1.LKB1的敲除上调了 MMP-2的表达;2.LKB1通过竞争性结合Sp1抑制MMP-2的表达;3.LKB1可以抑制氧化应激和炎症反应;4.平滑肌特异性敲除LKB1促进AngⅡ诱导的小鼠AAA形成。