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β-葡聚糖酶水解谷物及真菌细胞壁中的p-葡聚糖,在多个领域尤其是饲养业和发酵工业中具有极大应用价值。索拉胶（Salecan）是由土壤杆菌ZX09分泌的一种新型的水溶性线性p-1,3-葡聚糖,具有多种生理活性。索拉胶多糖分子量高达2×106Da,溶液粘度较高,使得索拉胶在生理活性研究及医药领域的应用受到限制。利用索拉胶作为多糖降解菌的筛选底物,一方面可获得葡聚糖酶及其产生菌；另一方面可获得水解索拉胶的高效酶源。该研究对于进一步挖掘新型葡聚糖酶,以及制备和研究具有生物活性的新型β-1,3-葡聚寡糖都有着非常重要的意义。通过观察粘度下降和CTAB-透明圈的形成情况,分离到一株索拉胶降解菌株S09。S09菌好氧,细胞为杆状,革兰氏染色阴性,可利用的碳源包括淀粉、茯苓聚糖、昆布多糖、燕麦粉、酵母葡聚糖、黄原胶和索拉胶,不能利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、纤维素和木聚糖。S09菌具有耐盐性,能在含7.0%NaCl的培养基中生长。16SrDNA同源性分析鉴定该菌为类芽孢杆菌（Paenibacillus sp. S09）。S09能分泌p-1,3-1,4-葡聚糖酶、p-1,3-葡聚糖酶和索拉胶水解酶。通过单因素试验和响应面分析,对S09菌产索拉胶水解酶培养基进行优化。最佳发酵培养基（Hty）组成为：索拉胶7.0g,尿素0.7g,磷酸二氢钾0.5g,无水氯化钙0.1g,七水合硫酸镁0.15g,七水合硫酸亚铁0.015g,氯化锌0.0025g,水1000mL, pH7.9。接种量为4%时,35℃下发酵30h,发酵上清液中索拉胶水解酶酶活达到15.2U/mL。1%（w/v）的索拉胶溶液中添加1%（v/v）的粗酶液后孵育,10min内能使粘度急剧下降至水样状态,同时伴随大量还原糖的生成。从S09菌基因组文库中筛选到p-1,3-1,4-葡聚糖酶基因plicA,全长为717bp,编码238个氨基酸,N端1-26个残基组成信号肽。将去除信号肽基因序列的plicA构建到pET29a上,转化E.coli BL21（DE3）中重组表达。镍柱纯化后测定酶学性质,最适反应温度和pH分别为55℃和6.2。以大麦β-葡聚糖为底物,重组PlicA酶比酶活为7055U/mg,米氏常数Km和最大反应速率Vmax值分别为3.7mg/mL和3333.3μmol min-mg-1。 PlicA酶可耐受pH范围为pH3.5～12.0,具有酸和碱稳定性。PlicA酶可耐受4MNaCl,孵育24h后保持至少90%的活性；0.5M的NaCl可将提高酶活力到1.5倍；具有耐盐性或盐激活性。PlicA酶是第一例同时具有耐酸、耐碱和耐盐特性,及高催化活性的细菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶。通过简并PCR、反向PCR和SEFA-PCR,从S09菌基因组中克隆到p-1,3-葡聚糖酶基因PglA,全长2631bp,编码876个氨基酸。PglA酶N端1-38个残基为信号肽序列。PglA酶为多区域酶,包括三个结构域：N端域、GH16催化域和C端Ig-like域。截短表达试验设计5个PglA酶的截短衍生物rPglA△C, rPglA△N, rPglA-CD, rPglA-N和rPglA-C。四个含催化域的酶rPglA、rPglA△C、rPglA△N和rPglA-CD的最适反应温度分别为60℃、60℃、50℃、60℃；最适反应pH分别为5.5、6.5、5.5、6.0。C端结构域的去除提高酶的最适反应温度。rPglA-CD酶热稳定性最高,其次为rPglA△C, C端结构域的去除明显提高了酶的热稳定性。PglA酶专一性水解β-1,3-葡聚糖,N端或C端域可提高酶对不溶性糖的催化活性,并可提高酶对底物的亲和力和催化效率。N端或C端域专一性结合β-1,3-葡聚糖底物,属于碳水化合物结合域（CBMs）。该结果揭示了β-1,3-葡聚糖酶C端Ig-like域对酶活性和稳定性的影响。采用硫酸铵沉淀、离子交换层析和凝胶过滤层析,纯化了类芽孢杆菌S09胞外索拉胶水解酶Sal A。Sal A酶是分子量为170kDa的糖蛋白,糖含量为18.5%。经质谱鉴定和de novo测序获得7条肽段序列。通过简并PCR和SEFA-PCR获知SalA酶基因序列。salA基因全长4374bp,编码1457个氨基酸,N端1-32个残基组成信号肽。SalA酶为多区域酶,从N端至C端,依次为右手β-螺旋催化域（Betahelix）,碳水化合物结构域4或9家族（CBM49）, F5/8C结构域（F5/8type C）、细菌免疫球蛋白相似域（Big2）和两个非典型糖类结合域（Sugar binding）。 SalA酶专一性水解索拉胶多糖,最适反应温度和pH分别为70℃和pH6.0,具有耐温性（65℃）和酸碱稳定性（pH3.0～10.0）,酶活力为251.1U/mg, Km和Vmax值分别为11.1mg/mL和833.3μmol min-1mg-1。 SalA酶是第一个进行分离和研究的新型索拉胶水解酶。SalA酶水解索拉胶多糖的终产物为分子量和结构均一的索拉胶寡糖（S08）,电喷雾质谱测定其分子量为1484Da,1H和13C核磁共振分析其糖链结构为：α-D-Glcp-（1→3）-[β-D-Glcp-（1→3）-β-D-Glcp-（1→3）]3-D-Glcp。通过与索拉胶多糖的NMR图谱比较,判断是S08两端的葡萄糖残基上均携带一个甲基和一个羧丙基。SalA酶专一性地作用于索拉胶多糖底物中两个α-葡萄糖残基之间的α-1,3-糖苷键,属于一种新型α-1,3-葡聚糖酶。索拉胶寡糖可清除DPPH自由基,具有体外抗氧化活性。小鼠体内试验表明索拉胶寡糖对环磷酰胺致免疫低下小鼠具有恢复作用,可升高脾脏指数和白细胞数目至正常水平,表明索拉胶寡糖具有一定的免疫调节活性。综上研究表明,以索拉胶作为筛选底物获得的降解菌株Paenibacillus sp. S09,是-种新型葡聚糖酶产生菌,从S09菌中获得的p-1,3-1,4-葡聚糖酶PlicA、β-1,3-葡聚糖酶PglA和索拉胶水解酶SalA具有优良的酶学特性,可应用于饲养、酿酒和医药等行业中。