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目的:克隆金黄色葡萄球菌的Panton-Valentine杀白细胞毒素(PVL)基因,构建原核表达载体pET28a/lukS-PV和pET28a/lukF-PV,表达LukS-PV和LukF-PV重组蛋白,利用此重组蛋白免疫新西兰白兔制备多抗血清。方法:根据PUBMED公布的PVL序列设计引物,并引入BamH I和Xho I酶切位点。应用PCR扩增出lukS-PV和lukF-PV全长基因片断。将目的基因lukS-PV和lukF-PV分别插入克隆载体pGEM-T,提取重组质粒,BamH I和Xho I双酶切获得目的基因,插入原核表达质粒pET28a中,重组子双酶切、PCR和测序鉴定,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)plysS并以IPTG诱导表达。亲和层析法纯化重组蛋白,SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白,并以此免疫新西兰白兔,收集抗血清,ELISA测定滴度,Western blotting鉴定免疫活性。结果:PCR从PVL阳性的金黄色葡萄球菌铜23株中扩增出939bp的lukS-PV和978bp的lukF-PV目标基因片断。并成功克隆入pET28a。pET28a/lukS-PV和pET28a/lukF-PV经BamH I和Xho I双酶切,获得与目标基因大小一致的基因片断,测序结果与GenBank比对LukS-PV和LukF-PV同源性均达99%。携带有pET28a/lukS-PV和pET28a/lukF-PV。重组质粒的宿主菌Rosetta(DE3)plysS分别经诱导高效表达上述两种蛋白质。SDS-PAGE检测其分子量:rLukS-PV和rLukF-PV的分子量分别约为38kDa和39kDa,二者与预期的分子量相符。经Ni亲和层析法纯化了rLukF-PV蛋白,免疫新西兰白兔,获得ELISA滴度为10-3的多价特异性抗血清,Western blotting显示,多价血清不仅能和其相应的重组蛋白而且和PVL阳性的金黄色葡萄球菌发生特异性免疫反应。结论:成功的从PVL阳性的金黄色葡萄球菌基因组中获取了lukS-PV和lukF-PV基因,构建了pET28a/lukS-PV和pET28a/lukF-PV重组质粒,并表达了相应重组蛋白,进而用rLukF-PV免疫新西兰白兔获得了多克隆抗血清。本研究为建立免疫法快速检测PVL阳性金黄色葡萄球菌奠定基础。