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桑树(Morus alba L.)是一种多年生双子叶木本植物。桑叶是家蚕最佳的天然食源;桑椹是桑树的果实,味道甘甜可口,果肉多汁,营养丰富,作为一种新型的绿色水果备受人们的青睐。桑树具有很多广泛用途,包含营养保健、中医资源及生态保护等。类黄酮(Flavonoids)是一类重要的植物次生代谢产物,常以结合态或自由态形式存在于许多食源性植物中。槲皮素(Quercetin)是最典型的类黄酮化合物。类黄酮3–O–葡萄糖基转移酶(UFGT)是催化糖基从尿苷–5′–二磷酸二钠盐(UDP)–葡萄糖转移至槲皮素形成槲皮素3–β–D–葡萄糖苷的一类转移酶基因,研究该基因的表达和功能,对了解植物类黄酮的合成和积累机制具有重要意义。在前期的研究中,已从桑树中克隆并鉴定了花青素生物合成途径的关键酶基因,并进行了信息学分析,但没有分析桑树MaUFGT基因的功能。本研究以多年保存的果桑种质资源‘嘉陵40号’的组织为材料,采用分子生物学等研究方法,研究该基因在花青素生物合成途径中的功能。为果桑新品种选育及利用基因工程方法调控桑椹花青素的生物合成奠定基础。主要研究方法及结果如下:1、桑树MaUFGT基因在不同组织中的表达分析利用qRT-PCR技术研究了MaUFGT基因在桑树各组织和发育期的表达水平。结果表明:随着果实发育成熟,MaUFGT1、MaUFGT2和MaUFGT3的表达模式相似,均呈上升趋势;在从顶芽依次向下的不同叶位中,3个UFGT基因的表达呈现先降低后升高,再降低又升高的趋势;在幼茎皮层和托叶中大量表达,幼茎表皮和木质部、叶柄中表达量较低,有的甚至不表达。MaUFGT2的表达量在3个基因中都是最高的,推测MaUFGT2基因是该基因家族的主效基因。2、桑树MaUFGT基因生物信息学分析及MaUFGT2基因克隆通过生物信息学方法,从川桑基因组数据库中鉴定出3个UFGT基因,并对其进行生物信息学分析。另外,从果桑品种‘嘉陵40号’的成熟果实中克隆了主效基因UFGT2,命名为MaUFGT2,登录号KP455729.1。其cDNA全长为1 386 bp,编码461个氨基酸,推测蛋白质分子量约为51 kDa,理论等电点为7.77。序列比对结果发现所编码的蛋白在不同物种间保守性不高。3、桑树MaUFGT2基因原核表达与功能分析将MaUFGT2基因连接到pET-28a(+)表达载体中,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,加入IPTG至终浓度为0.4 mmol/L,表达产物经SDS-PAGE分析显示,表达蛋白大小约为52 kDa,主要以包涵体形式存在,在上清液中也有少量表达。采用超声波破碎方法裂解细胞,然后用8mol/L尿素溶解表达产物,通过Ni-NTA柱对破碎的包涵体溶液中的表达蛋白进行分离纯化,收集融合蛋白,纯化后的目的蛋白经Western Blot检测,采用含有氧化还原系统的复性缓冲液分步进行透析复性,最终获得了活性蛋白。MaUFGT2蛋白经纯化和复性后,最后通过高效液相色谱(HPLC)分析该蛋白的酶活性,结果表明,体外酶活性鉴定MaUFGT2能够催化UDP-葡萄糖转移至槲皮素形成槲皮素3–β–D–葡萄糖苷,验证了其具有葡萄糖基转移酶的功能。