基于功能核酸的水体重金属检测新方法研究

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随着工农业生产的高速发展,环境中重金属污染问题日益突出。水体重金属污染因其毒性大、易生物富集及稳定难分解受到了人们普遍关注,致使环境监测部门对水体重金属的检测质量和速度要求越来越高。传统的重金属检测方法需要大型仪器设备,难以满足现场或在线监测。因此,建立简便、可靠、快速有效的水体重金属检测方法,具有重要的研究意义和实用价值。目前,基于功能核酸的生物传感器重金属检测方法,以其具有功能核酸靶标范围广、易修饰和筛选且检测灵敏度高、特异性好等特点,在重金属快速检测中得到了广泛应用。但此类方法,传感体系大多设计复杂、所用物质难觅、不易推广,因此研究一些传感体系简单,组分易得的新检测方法十分必要。本论文在选择As(III)适配体,Ag+、Cu2+特异性DNA,富G核酸序列和设计整合功能核酸的基础上,结合常规易得的功能分子或染料,研究确立了基于功能核酸的水体重金属As(III)、Ag+、Cu2+、Pb2+、Hg2+纳米金比色、荧光及胶体金试纸条等检测新方法,这些方法为水体重金属的快速检测提供了技术手段,并具一定的推广应用前景。主要研究结果如下:(1)确立了一种基于砷适配体和纳米金(AuNPs)比色法检测水体As(III)的新方法,传感体系由AuNPs、砷适配体及NaCl组成。最佳检测条件为:500μL的传感体系中含AuNPs 200μL,聚集该浓度AuNPs的NaCl浓度为0.12 M,适配体浓度为20 nM,孵育时间和反应时间均为10 min。该方法检测特异性好,线性范围为1.26-80 ppb,检测下限为1.26 ppb,低于EPA和WHO规定的饮用水中As(III)最高限量浓度(10 ppb),加标回收率为93.6%-105.6%。(2)在基于AuNPs聚集的比色法基础上引入罗丹明B(RhoB),将比色信号转化为荧光信号,确立了一种利用银离子特异性DNA(Ag-CC)调节AuNPs的聚散,淬灭RhoB荧光的水体Ag+检测新方法。传感体系由AuNPs、Ag-CC、NaNO3及RhoB组成。最佳检测条件为:500μL的传感体系中含250μL AuNPs,0.12 M NaNO3,15 nM Ag-CC和8μM RhoB。该方法检测特异性好,线性范围为2.73-200 ppb,检测下限为2.73 ppb,低于EPA和WHO规定的饮用水中Ag+的最高允许值(50 ppb),加标回收率为99.9%-102.7%。(3)发现一段对Cu2+有特异性识别功能的单链核酸片段Cu100,基于此铜离子特异性DNA和SYBR Green I(SG),确立了一种荧光法检测水体Cu2+的新方法。传感体系由Cu100和SG组成。最佳检测条件为:500μL的传感体系中含0.3×SG,20 nM Cu100及150μM抗坏血酸钠。该方法检测特异性好,线性范围为5.57-250ppb,检测下限为5.57 ppb,远低于EPA规定的饮用水中Cu2+最大允许值(1.3 ppm),加标回收率为98.5%-104.8%。(4)利用荧光标记及非标记的富G核酸序列,分别确立了一种基于Pb2+诱导G-四联体形成淬灭荧光直接检测水体Pb2+的新方法。其中荧光标记法的传感体系由FAM标记的富G序列T30695(FAM-T30695)组成。最佳检测条件为:500μL的传感体系中含25 nM FAM-T30695,反应时间为5 min。非标记法的传感体系由T30695和SG组成。最佳检测条件为:500μL的传感体系中含4×SG及50 nM T30695,最佳作用顺序为T30695+Pb2++SG。两种方法都有良好的检测特异性,线性范围分别为0.77-20 ppb和3.79-100 ppb;检测下限分别为0.77 ppb和3.79 ppb,均低于EPA和WHO规定的饮用水中Pb2+最高限量浓度(15 ppb);加标回收率分别为95.3%-110.8%和97.5%-110%。(5)在富G核酸序列T30695的两端各增加6个T,得到兼具识别Hg2+和Pb2+能力的整合功能核酸modified T30695,基于modified T30695和荧光染料GeneFinder?(GF),确立了一种荧光法检测水体Hg2+和Pb2+的新方法。传感体系由modified T30695和GF组成。最佳检测Hg2+的条件为:500μL的传感体系中含50 nM modified T30695,0.3×GF。该方法检测特异性好,线性范围为3.23-40 ppb,检测下限为3.23 ppb,低于WHO规定的饮用水中Hg2+最高限量浓度(6 ppb),加标回收率为98.5%-106%。最佳检测Pb2+的条件为:500μL的传感体系中含50 nM modified T30695,2.4×GF。该方法也有良好的检测特异性,线性范围为2.62-80ppb,检测下限为2.62 ppb,低于EPA规定的饮用水中Pb2+最高限量浓度(15 ppb),加标回收率为98.6%-103.6%。(6)开展了基于砷核酸适配体的侧向层析胶体金试纸条的研制。通过试验不同设计方案,确定在试纸条的连接垫和检测线上固定砷适配体,在控制线上固定砷适配体互补链。由此研制出的试纸条可对As(III)定性,或半定量检测浓度低至10ppb的As(III),并具一定特异性。实验结果揭示了As(III)与其适配体之间可能同时存在分子内和分子间作用。论文在利用DNA性质的功能核酸取代Cu2+依赖型DNAzyme检测Cu2+,基于G-四联体直接检测Pb2+,设计整合功能核酸进行双靶标检测,将均相型传感体系转移至固相载体等方面做出了一定的创新,不足之处在于离实际应用及商品化推广尚有一定距离,后续研究将朝此方向努力。
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