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目的：
Vps24(vacuolar protein sorting24)是转运必需内吞体分选复合物(endosomalsorting complex required for transport，ESCRT)中ESCRT-Ⅲ复合物的重要组成部分。ESCRTs的主要功能包括，介导泛素化的内吞体膜蛋白分选，形成多泡体(multivesicular body，MVBs)，并转运入溶酶体进行降解，从而调控受体信号通路。它也能够调控胞质分裂、病毒包装、出芽及自噬等。ESCRTs由四类具有不同生物学功能的蛋白复合物构成，即ESCRTs-0，-Ⅰ，-Ⅱ，和-Ⅲ，它们通过精密的分工协作识别并分选泛素化膜受体[1]。ESCRT-Ⅲ是一种动态多聚体，主要由四种核心亚基构成，即Vps20，Snf7，Vps24和Vps2[2]。在MVBs形成过程中，Vps24与ESCRTs的其他成员共同作用，使囊泡膜内化入腔，并实现腔内囊泡与内体膜的最终分离[3]，从而介导受体信号通路的调控。
Ⅱ型肺泡上皮细胞（typeⅡ alveolar epithelial cell，AEⅡ）是末梢肺组织中的重要细胞系，具有合成、分泌表面活性物质(PS)，增殖分化以补充AEⅠ，及参与免疫调控等功能。体外研究表明，原代分离培养的AEⅡ，其特征分子SPC的表达和板层小体等会随着时间的推移而逐渐降低，转分化为AEⅠ[4，5]。而在体内，AEⅡ是AEⅠ的祖细胞，随着肺泡上皮的发育和分化，SPC的表达升高。由此可知，内环境稳态与维持AEⅡ分泌PS有关。板层小体是AEⅡ合成分泌储存PS的主要结构，而多泡体是板层小体的前体[6]。也有文献指出，ESCRTs对哺乳动物上皮细胞的极性维持具有重要作用，敲除ESCRTs成员Tsg101可使上皮细胞失去极性[7]。因此，ESCRTs可能在末梢肺组织稳态维持中具有重要作用。MLE12(MouseLung Epithelial12)细胞是AEⅡ的近似细胞系，以其为研究对象，用以探究AEⅡ在末梢肺组织稳态维持中的重要作用。
本课题以探寻Vps24的功能为核心，借助体外重组技术构建表达载体，建立高表达Vps24的稳定转染细胞系，并初步分析高表达Vps24对MLE12细胞生物学特性的改变。
方法：
1、重组质粒的构建
2、细胞培养
3、基因转染及稳定筛选
4、Western Blotting
5、碘化丙啶染色
6、Realtime PCR
7、RT-PCR
8、统计分析
结果：
1、成功构建外源性高表达Vps24的重组质粒
将小鼠的Vps24全长编码区基因克隆入pcDNA3.1/myc-His-B真核表达载体
2、成功建立外源性高表达Vps24的稳定转染细胞系
将重组质粒转染入MLE12细胞并进行稳定筛选及鉴定，得到外源性高表达Vps24的稳定转染细胞系M12V24
3、外源性高表达Vps24能够增强ESCRTs行使胞质分裂的能力
流式细胞技术检测细胞周期可知，Vps24的过表达能够增强ESCRTs行使胞质分裂的能力，消解多倍体。
4、外源性高表达Vps24显著降低E-cadherin mRNA表达水平
随机选取的10个M12V24阳性单克隆中，9个单克隆的E-cadherin mRNA表达水平均出现明显的降低，提示Vps24的过表达可能影响MLE12细胞的分化。
5、外源性高表达Vps24不能显著增强Bleomycin诱发EMT
(1) Bleomycin处理细胞后，在我们观察的时间段内，细胞形态均发生一定改变，并未出现明显的上皮细胞表型变为间质细胞表型
(2) Realtime PCR检测可知，细胞并未发生Vimentin mRNA表达水平的明显升高
6、Tunicamycin诱发ER Stress体外模型的确立
(1)通过活细胞计数，确定Tunicamycin诱发ER Stress的最佳浓度为6ng/ml
(2)通过检测Bip mRNA表达水平及XBP-1剪切情况，确定Tunicamycin诱发ER Stress最佳时间为24小时
7、ER Stress及Vps24过表达与ER Stress联合作用均不能诱发EMT
(1)在正常MLE12细胞培养条件下，经Tunicamycin处理后，细胞并未由上皮细胞表型变为间质细胞表型
(2) Realtime PCR检测可知，细胞并未发生Vimentin mRNA表达水平的明显升高
结论：
外源性高表达Vps24能够增强ESCRTs行使胞质分裂的能力，显著降低MLE12细胞E-cadherin表达水平;在现有条件下，高表达Vps24不能使MLE12细胞对促纤维化试剂Bleomycin更为敏感;ER Stress与其联合作用，不能促进MLE12细胞发生EMT转化，表明外源性高表达Vps24可能通过下调E-cadherin表达水平介导MLE12细胞的分化调控。