目的:即刻早期基因(Immediate early gene)编码一类对细胞调节和刺激应答中有重要作用的多肽,这类基因在不同的细胞中有不同的表达。慢动力即刻早期基因对刺激的应答有一个延迟作用,导致其转录翻译相对较慢,应答时间更长。早期快速反应基因5(immediate-early response gene 5,IER5)属于慢动力即刻早期基因家族的一员。有研究揭示在Hela细胞中IER5基因受辐射后转录或翻译水平上调。尽管国内外学者对IER5基因的生物学功能和特性有所了解,但是转录因子对IER5基因的调控机制的探索较少,特别是在辐射条件下的调控机理尚不清楚。结合本课题前期的研究工作,发现NFI很有可能是IER5基因调控的一个转录因子。同时,宫颈癌的放疗效果因个体差异非常大,如何增加其放疗效果在临床上是一个难题。本课题旨在探究NFI是否参与辐射对IER5基因的转录调控作用及其转录调节机制;拟通过利用体外蛋白表达系统——昆虫杆状病毒表达系统大量表达和纯化IER5蛋白,借生物信息学技术对IER5的蛋白结构进行预测,为后期通过实验测定蛋白质结构提供思路和今后临床上放疗增敏和药物开发提供理论依据。方法:(1)构建IER5基因启动子系列缺失体的报告载体,并把构建好重组载体转染进HeLa细胞,采用双荧光素报告基因实验找到IER5启动子调控关键区域。通过生物信息学技术预测IER5基因启动子上NFI的结合位点。(2)构建NFIA、NFIB、NFIC和NFIX的过表达载体和siRNA,分别检测辐射组和未辐射组IER5基因转录活性、mRNA和蛋白质水平的变化情况,确定NFI家族对IER5基因调控的成员及辐射对NFI调控IER5的影响。(3)通过EMSA实验比较辐射组和未辐射组NFIC在体外结合到IER5基因启动子上的情况。(4)分别利用ChIP-PCR和ChIP-qPCR查看IER5基因启动子区NFIC蛋白富集效率的变化。(5)构建重组转移载体pFastBac1-IER5,利用EcoRI和Hind Ⅲ酶双酶切和琼脂糖凝胶电泳鉴定重组转移载体。(6)将重组转移载体pFastBac1-IER5转化至感受态大肠杆菌DH10Bac来构建重组穿梭质粒rBacmid-IER5,利用穿梭载体Bacmid的M13通用引物鉴定。(7)用P2重组杆状病毒转染Sf9细胞,观察到细胞出现明显病变后用间接免疫荧光看重组蛋白表达情况。(8)用P2重组杆状病毒转染Sf9细胞,观察到细胞出现明显病变时,收集细胞及提取蛋白质。SDS-PAGE分离鉴定蛋白。同时,将未进行考马斯亮蓝染液染色样品转印至NC膜上,进行Western Blot分析。(9)利用生物信息学在线分析工具对IER5蛋白质理化性质、二级结构及三级结构等特点进行预测分析。结果:(1)IER5基因在HeLa细胞中特异性调控的区域位于-249bp～-63 bp,且辐射上调了IER5基因启动子转录活性。利用定点突变技术将NFI结合位点的GATT突变成ATCC,突变NFI位点后,IER5启动子转录活性显著下降。(2)转入siNFIC后,IER5转录活性、mRNA水平和蛋白质表达不同程度地下调,但辐射能逆转这种下调作用;转入NFIC过表达重组载体pcDNA3.1-NFIC后,IER5转录活性、mRNA水平和蛋白质表达不同程度地被上调,且辐射能进一步加强这种上调作用。(3)EMSA实验显示,在体外NFIC能直接作用于IER5基因启动子上,但这种作用不受辐射调控。(4)ChIP实验显示,在体内NFIC能明显富集到IER5基因启动子上,但富集效率不受辐射的影响。(5)电泳结果显示在1000 bp和4500bp处有2条与预期大小一样的条带,说明成功构建了重组杆状病毒转移载体pFastBac1-IER5。(6)PCR鉴定结果显示在3300bp左右出现1条条带,表明成功制备了重组穿梭质粒rBacmid-IER5。(7)重组杆状病毒感染细胞后,细胞直径慢慢增加,折光性变强;IFA结果显示感染重组病毒的细胞出现绿色荧光,而未感染细胞没有出现荧光。(8)SDS-PAGE和Western blot结果显示,在48 kDa处出现特异性条带,而野生型杆状病毒感染组未出现特性性条带。(9)生物信息学分析提示带负电荷的氨基酸残基占12.84%,带正电荷的氨基酸残基占9.48%;总分子量为33703.69;理论等电点PI=4.91;不稳定系数为61.1;该蛋白质为亲水性蛋白质;二级结构显示IER5蛋白有6个α螺旋,无β折叠和β转角,其余大部分处于无规则卷曲状态。结论:在HeLa细胞中辐射能上调IER5的表达,NFIC通过直接结合到辐射敏感基因IER5启动子上而上调其表达,但是NFIC没有参与辐射对IER5基因的调控作用;成功用昆虫杆状病毒表达系统在体外表达了 IER5蛋白;利用生物信息学预测了蛋白质空间结构,并给出了三级结构模式图。