研究背景 动脉粥样硬化是一种多因素疾病，年龄、性别、高血压、糖尿病、高脂血症等被视为AS的经典危险因素。越来越多的证据表明，炎症在AS的发生和发展过程中扮演着重要的角色。从最开始的炎症细胞浸润、泡沫细胞形成、内皮功能障碍、脂质条纹及粥样硬化斑块出现、乃至最终的冠状动脉事件如急性冠状动脉综合征的发生等均和炎症有着密切关系。内皮是血管的重要保护屏障，血管内皮功能障碍作为AS病理过程中的一个早期全身性改变，和巨噬细胞等参与的炎症反应贯穿着AS发生、发展的全部过程，是动脉粥样硬化性疾病发生的核心环节，也是该类疾病防治的主要靶点之一。 血管内皮结构的完整性和功能状态与AS发生、发展以及血栓事件的发生密切相关。血管内皮不但是防止巨噬细胞浸润、泡沫细胞形成、防止AS发生的一道重要防线，而且是凝血因子合成、分泌以及调整凝血功能的重要生理结构。因此，广义上讲血管内皮功能除了包含其血管舒张功能外，还包括其调整凝血功能、抗血栓形成的内容。 C—反应蛋白是炎症反应的一个重要标志物，同时也是体内重要的促炎症细胞因子。许多研究表明，CRP可作为心血管事件的有力预测因子。同时，也不断有研究证实CRP不仅可作为炎症标记物和心脏事件的预测因子，其本身还能使内皮细胞粘附分子分泌增加而促进炎症细胞粘附、诱导巨噬细胞分泌组织因子、基质金属蛋白酶等而促进凝血和分解细胞外基质，也能使内皮细胞及血管平滑肌细胞等一氧化氮表达及分泌降低而内皮素-1表达和分泌增加。因此，许多学者认为CRP本身可能就是促AS的危险因素，和血管内皮功能障碍之间存在着因果关系。但目前这一领域的研究存在很多争议，对CRP在AS和内皮功能障碍中究竟是仅仅作为旁观者角色的标记物还是兼有促AS效应，目前仍无定论。 本研究拟分三部分对炎症及其标记物CRP与血管内皮功能的关系及其机制进行初步研究，并探讨阿托伐他汀对其影响。 第一章炎症对高脂饮食兔血管内皮功能障碍的影响及阿托伐他汀的干预效应 目的：建立新西兰兔高脂饮食致高脂血症和血管内皮功能障碍模型，并评价炎症在其中的作用和阿托伐他汀的干预效应。 方法：16只新西兰兔随机分为单纯高脂饮食组和高脂饮食加阿托伐他汀组，分别测定总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯、C—反应蛋白，白介素—6、一氧化氮、内皮素-1、无创超声评价的血管内皮功能的基础水平。8周后再次复查上述参数并在A—HF组撤去阿托伐他汀和高脂饮食，分别于撤药1、4、7天后再次测定上述参数。 结果：8周的高脂饮食可引起明显的高脂血症，升高炎症标记物水平，导致ET-1/NO的失衡并引起内皮功能障碍。阿托伐他汀治疗能显着改善上述状况，但并不能将其控制到基线水平。阿托伐他汀撤药1、4、7天后未能引起明显的血脂水平变化，但4天和7天后出现明显的炎症标志物水平明显升高，并导致内皮功能障碍加重，且该效应独立于血脂水平的变化。 结论：高脂饮食能引起内皮功能障碍，该效应与炎症密切相关，阿托伐他汀能明显地反向调节该效应。阿托伐他汀突然撤药可导致炎症反应的反弹增强并使内皮功能障碍加重，该效应独立于血脂水平的变化而与炎症密切相关。这可能是他汀类撤药引起心血管事件明显增加的重要机理。 第二章 C—反应蛋白在血管内皮功能障碍中的作用 第一节重组人CRP和IL—6注射的时效研究及其对下丘脑—垂体—肾上腺轴的影响 目的：了解重组人CRP静脉注射及重组人IL—6皮下注射对兔血浆CRP浓度的时间、浓度变化，为下一步研究确定合适剂量和干预后参数检测时间。 方法：18只新西兰兔随机分为CRP组和IL—6组2大组，其中每3只又分别按照rhCRP和rhIL—6使用剂量的不同分为3个亚组。rhCRP的使用剂量分别为0.25、0.5、1.0 mg/kg，rhIL—6的使用剂量分别为0.1、0.4、1.6μg/kg。分别于注射前注射后1h、2h、4h、8h、24h、48h及7days抽取血样，CRP组检测注射后CRP浓度，IL—6组于注射后检测IL—6和CRP浓度。同时，在两组各时间点均检测血管加压素、促肾上腺皮质激素、皮质醇水平以了解rhCRP和rhIL—6注射是否对下丘脑—垂体—肾上腺轴产生明显影响。 结果：rhCRP注射后血浆CRP浓度于1h后到达峰值并于7天后回落到基线水平。rhIL—6注射后IL—6水平于4h后到达峰值并于24h后回落到基线水平。而相应的CRP水平于rhIL—6注射后24h达峰，7天后回落到基线水平。各剂量组rhCRP注射均未对HPA产生明显影响，0.1和0.4μg/kg的rhIL—6注射也未对HPA产生明显影响，而1.6μg/kg的rhIL—6注射致AVP、ACTH及Cortisol水平明显上升。 结论：rhCRP、rhIL—6注射均能使血CRP水平明显升高，且合适剂量的注射不会对HPA产生明显影响。因此，该法可分别作为外源性和内源性升高体内CRP浓度的有效方法。 第二节 CRP对血管内皮功能的影响 目的：探讨C—反应蛋白对内皮功能的影响，明确其在内皮功能障碍中的作用。 方法：实验用新西兰兔随机分为正常饮食的对照组和高脂饮食组组。测定基础水平的TC、LDL—C、TG、CRP、IL—6、NO、ET-1，并无创超声评价的内皮功能，4周后再次测定上述参数。再以rhCRP静脉注射或rhIL—6皮下注射以升高体内CRP浓度。因上述预试验证实rhCRP注射后2h以及rhIL—6注射后24h时血浆CRP浓度接近峰值，故分别于rhCRP注射后2h和rhIL—6注射后24h再次测定上述参数。 结果：4周的高脂饮食可致明显的高脂血症、升高炎症标记物水平，并出现明显的内皮功能障碍。不管是内源性还是外源性途径使CRP水平明显升高，均可使高脂血症所致的内皮功能障碍进一步加重而对无内皮功能障碍的非高脂血症兔的内皮依赖性血管舒张功能无明显影响。 结论：CRP能进一步恶化高脂血症诱导的血管内皮功能障碍，但对无内皮功能障碍兔的内皮依赖性血管舒张功能无明显影响。因此，CRP对血管内皮功能的直接影响主要取决于内皮功能状态本身。 第三章 CRP对人脐静脉内皮细胞TF/TFPI及PAI-1表达与活性的影响及阿托伐他汀的调节效应 第一节 CRP对人脐静脉内皮细胞TF/TFPI及PAI-1表达及活性的影响及其机制探讨 目的：了解CRP对人脐静脉内皮细胞(HUVEC) TF、TFPI、PAI-1表达及其活性的影响。 方法：HUVEC细胞株复苏后稳定传4代后作为实验用细胞，台盼蓝染色法观察细胞活力，酶联免疫吸附法(ELISA)测定TF、FTPI、PAI-1抗原的表达，real—time RT—PCR检测TF、TFPI、PAI-1的mRNA表达，Westernblot检测酸化的IκB—α(P—IκB—α)蛋白水平，以发色底物法测定TF、TFPI、PAI-1活性，电泳迁移率转变试验(Electrophoretic mobility shift assay，EMSA)检测核因子—κB(NF—κB)活性。 结果：各浓度CRP对HUVEC细胞活力无明显影响；CRP呈剂量依赖性和时间依赖性地促进TF及PAI-1抗原表达，抑制TFPI抗原表达，使TF及PAI-1 mRNA表达增强而使TFPI mRNA表达降低；CRP使TF、PAI-1活性增加，而使TFPI活性降低；CRP使P—IκB—α蛋白表达明显上升，并使NF—κB活性增强。NF—κB抑制剂PDTC干预可使CRP介导的TF、PAI-1基因及抗原表达及活性明显减弱，使TFPI基因及抗原表达及活性明显增强。 结论：CRP通过IκB/NF—κB通路在转录和蛋白水平上剂量、时间依赖地使HUVEC细胞TF和PAI-1表达增强，并提高TF、PAI-1活性，降低TFPI表达及活性。 第二节阿托伐他汀对CRP诱导HUVEC细胞TF/TFPI和PAI-1表达及活性的影响及其机制探讨 目的：观察阿托伐他汀对CRP诱导HUVEC细胞TF、TFPI、PAI-1表达及活性的影响并探讨其机制。 方法：HUVEC细胞株复苏后稳定传4代后作为实验用细胞，台盼蓝染色法观察细胞活力，酶联免疫吸附法(ELISA)测定TF、FTPI、PAI-1抗原的表达，real—time RT—PCR检测TF、TFPI、PAI-1的mRNA表达，Westernblot检测磷酸化的IκB—α(P—IκB—α)、磷酸化的NF—κB—p65(P—NF—κB—p65)，Akt(P—Akt)蛋白表达水平，以发色底物法测定TF、TFPI、PAI-1活性，EMSA法测定NF—κB活性。 结果：阿托伐他汀能明显反向调控CRP干预的HUVEC细胞TF、TFPI、PAI-1的mRNA、抗原表达及活性。阿托伐他汀剂量依赖性地抑制CRP干预的HUVEC细胞NF—κB活性，但未能明显降低IκB—α的降解，能明显降低CRP干预的HUVEC细胞P—NF—κB—p65及P—Akt表达。PI3K抑制剂LY294002能明显地使CRP干预的HUVEC细胞P—Akt及P—NF—κB—p65表达降低而对P—IκB—α蛋白表达无明显影响。 结论：阿托伐他汀可通过PI3K/Akt/NF—κB通路而非IKK/IκBα/NF—κB通路反向调控CRP对HUVEC细胞TF/TFPI、PAI-1表达及活性的影响。