呼吸道合胞病毒（RSV）是引起婴幼儿、老年人及免疫功能缺陷患者下呼吸道感染的重要病原体。据报道,全球每年5岁以下儿童感染RSV人数达3,300万,死亡人数约为16万人。RSV的复感率高,2岁以下儿童超过90%至少感染过一次RSV,其中70%患者发生住院感染且并发细支气管炎、肺炎及哮喘,老年人常导致阻塞性肺病且伴有心肺并发症。RSV每年造成巨大的经济损失,并严重威胁人类健康,而研制RSV疫苗的工作自上世纪60年代开展至今,仍没有认证的有效疫苗上市。因此,WHO将RSV疫苗的研制列为急迫解决的问题之一。1960年,应用福尔马林灭活病毒后制备的FI-RSV疫苗应用于临床,其不但没有起到防控作用,反而引起免疫增强性疾病（ERD）从而导致2名患婴死亡。随后出现利用传统方法研制的多种RSV疫苗,虽然取得一定的成效,但大多止步于临床试验。亚单位疫苗被认为是最有可能发展为预防老年人感染RSV的疫苗,而减毒活疫苗是最有可能成为预防婴幼儿感染RSV的候选疫苗株。许多国际前沿研究对这两种疫苗形式也有很多探索。Qing Yan等人从临床标本分离采用连续传代方法筛选制备冷适应KM516-AS疫苗,但存在毒力返祖现象而未批准临床试验。Jin和Ruth等人采用反向遗传学、基因重组技术分别研制出rA2DM2-2及rA2cp248/404/1030ΔSH疫苗,Ⅰ期临床研究结果表现出良好的免疫原性及保护性,但因减毒不够或减毒过度等问题存在安全隐患。MedImmune、Novatis等研制的F蛋白亚单位疫苗（PFP）临床研究,Ⅰ期实验证实PFP用于健康成人、12个月以上的儿童和孕妇是安全的,具有免疫原性,但疫苗并没有完全解决偏向Th2免疫应答的问题,仍存在易引起免疫过激等安全性问题。因此,着力研制亚单位疫苗和减毒活疫苗,对RSV疾病的防治具有深远意义。选择优势的保护性抗原对RSV疫苗的制备至关重要。F蛋白是RSV病毒主要保护性抗原,具有高度的保守性,F蛋白被单克隆抗体作为识别靶点,现今大多数进入临床试验的RSV候选疫苗多选择F蛋白作为抗原靶标,在疫苗研究中应用广泛。近年来,将纳米技术应用于疫苗研究是近年来的热点,也被估计具有一千多亿的市场价值。无论是通过纳米颗粒自身激活或强化免疫,还是作为投递系统或免疫刺激佐剂增强免疫应答,都得到了广泛的探索和应用。预示着纳米颗粒有望使疾病的治疗和生物活性组分的递送发生革命性的变革。针对免疫途径的选择,鼻腔免疫所需的疫苗量和佐剂量较小,能够激发机体产生粘膜免疫应答后诱导系统免疫应答。同时,减毒活疫苗通过鼻腔免疫能模拟病毒的自然感染,引起局部黏膜和系统免疫,使机体获得更显著的免疫原性和更广泛的保护性。因此,基于以上现状,本研究立足于创新型RSV疫苗的制备。本研究分两个部分:一是通过构建重组RSV F蛋白自组装纳米颗粒疫苗,探索RSV F蛋白的抗原形式、免疫应答方式及免疫保护效果;二是采用冷适应流感病毒反向遗传学技术,构建嵌合RSV中和抗原表位的重组FLU/RSV/NA-3F减毒活疫苗,探索嵌合RSV中和抗原表位的重组FLU/RSV/NA-3F减毒活疫苗的免疫原性及免疫保护效果。一、重组RSV F纳米颗粒疫苗株构建及免疫效果研究本研究以RSV关键保护性抗原F蛋白分子为靶标,通过昆虫表达系统制备由多个F蛋白寡聚体自组装的纳米颗粒,并通过滴鼻免疫BABL/c小鼠,检验评价其免疫原性及免疫保护效果,为发展RSV新型疫苗提供试验依据。目的:制备重组RSV F纳米颗粒（RSV F NPs）疫苗,并对重组疫苗的免疫原性及免疫保护效果进行鉴定,对纳米颗粒型疫苗的实践性和可行性进行初步探讨。方法:应用生物信息学方法将野生型RSV F蛋白氨基酸进行点突变设计,使F蛋白糖基化修饰,同时对改造后氨基酸序列进行密码子优化。利用分子生物学技术构建pFastBacⅠ-F质粒,通过转座得到重组杆粒Bacmid-F,杆粒转染sf9细胞获得稳定表达的杆状病毒株。扩大培养后经超滤浓缩、亲和层析方法纯化F蛋白,采用Western blot、电镜等方法鉴定观察纳米颗粒组装情况。RSV F纳米颗粒疫苗滴鼻免疫BABL/c小鼠,ELISA法检测小鼠血清中特异性抗体及鼻肺灌洗液中s IgA抗体效价,微量中和检测针对RSV病毒的中和抗体,ELISPOT法检测脾淋巴细胞分泌特异性细胞因子水平。RSV A2株攻毒后,通过检测小鼠体重变化、病毒载量等指标判定重组RSV-F NPs免疫保护效果。结果:构建质粒及杆粒位置大小正确,纯度适当。重组病毒DNA大小正确病毒最佳接种MOI为0.1,获得重组病毒F-opt毒力为109TCID50/ml。WB鉴定65KD处有特异性条带,证明重组RSV F蛋白的表达。电镜观察纳米颗粒结构形态完整呈―玫瑰花‖状,证明纳米颗粒组装成功。滴鼻免疫BABL/c小鼠,试验结果显示:二免后10μg NPs低剂量组、30μg NPs高剂量组的特异性IgG、IgG1、IgG2a抗体效价均有明显升高,30μg NPs高剂量组二次免疫IgG效价达到103.682±0.05,明显高于10μg NPs低剂量组（P<0.001）。IgG1/IgG2a<1,表明重组RSV F NPs疫苗株能够产生偏向Th1型细胞免疫应答。与肌肉免疫组比较,滴鼻免疫组小鼠产生s Ig A型特异性抗体,30μg NPs高剂量组鼻灌洗液效价达到101.7±0.03、肺灌洗达到102.3±0.7。体外中和实验证明RSV F NPs疫苗能够激发小鼠产生中和抗体,30μg NPs高剂量组中和抗体效价达到102±0.13。检测脾细胞分泌的IFN-γ及IL-4细胞因子显著升高。攻毒后,免疫组的小鼠鼻肺病毒载量降低、小鼠体重无明显变化、肺部病理变化不明显、IL-4细胞因子无明显升高,初步说明疫苗没有造成ERD。结论:成功制备重组RSV-F NPs疫苗。动物试验证明重组RSV-F NPs疫苗能够有效刺激小鼠产生有效的黏膜免疫、细胞免疫及体液免疫应答,能够产生中和抗体,证明重组RSV-F NPs疫苗具有良好的免疫原性,攻毒试验证明重组RSV-F NPs疫苗具有良好的免疫保护效果。二、重组嵌合FLU/RSV/NA-3F疫苗株制备及免疫效果研究本研究利用冷适应流感病毒作为嵌合疫苗的载体,制备重组嵌合FLU/RSV/NA-3F减毒活疫苗。通过免疫BABL/c小鼠,对重组嵌合FLU/RSV/NA-3F减毒活疫苗的免疫原性和免疫保护效果进行评价。目的:制备重组嵌合FLU/RSV/NA-3F减毒活疫苗,评价重组嵌合FLU/RSV/NA-3F减毒活疫苗的免疫原性及免疫保护性,为研制安全、有效的重组RSV减毒活疫苗株提供数据支持。方法:利用生物信息学方法,对A/California/07/2009（H1N1）株NA基因进行改造,并将RSV F蛋白的中和表位II重复三次后通过柔性氨基酸连接,插入NA基因序列中,组成重组NA-3F目的基因。重组质粒与A/California/07/2009（H1N1）的HA及A/Ann Arbor/6/60（H2N2）的6质粒共组成八质粒,转染MDCK/COS1细胞后得到重组FLU/RSV/NA-3F病毒。经鸡胚传代扩增,得到稳定传代的候选疫苗株。通过血凝实验、TCID50、Western blot、电镜等方法对重组FLU/RSV/NA-3F疫苗株进行鉴定。纯化重组FLU/RSV/NA-3F疫苗株,10⁴TCID₅₀、10⁶TCID₅₀两剂量组滴鼻免疫BABL/c小鼠,ELISA法检测小鼠血清中特异性抗体及鼻肺灌洗液中s IgA抗体效价,HI检测小鼠血清中针对流感的中和抗体,微量中和检测针对RSV病毒的中和抗体,ELISPOT法检测脾淋巴分泌细胞因子水平。RSV A2株攻毒后,通过对小鼠体重变化、肺病毒载量及肺病理切片等指标,评价重组FLU/RSV/NA-3F疫苗株的免疫保护性。被动免疫后,用鼻肺病毒载量及肺病理切片评价疫苗的预防效果。结果:构建质粒位置大小正确,纯度适当,测序完全正确。用于重组八质粒基因序列正确,并成功拯救出重组FLU/RSV/NA-3F减毒活疫苗株。Western blot鉴定63KD处有特异性条带,证明嵌合蛋白的表达。电镜观察重组病毒结构完整,形态符合流感病毒特征。纯化病毒后血凝滴度为1:29,毒力为10⁸TCID₅₀/ml。体外复制结果证明重组FLU/RSV/NA-3F减毒活疫苗株与A/California/07/2009（H1N1）疫苗株具有相似的复制特性,最适温度33℃。10⁴TCID₅₀、10⁶TCID₅₀两剂量组滴鼻免疫BABL/c小鼠后,10⁴TCID₅₀、10⁶TCID₅₀两剂量组均产生针对RSV的IgG、IgG1、IgG2a型特异性抗体的升高,10⁶TCID₅₀高剂量二免后IgG效价达到103.372±0.126,高于10⁴TCID₅₀低剂量组（P<0.001）。IgG1/IgG2a<1,表明重组FLU/RSV/NA-3F减毒活疫苗株能够诱导小鼠产生趋于Th1型细胞免疫应答。免疫组小鼠产生明显的s Ig A型特异性抗体升高,10⁶TCID₅₀剂量组鼻灌洗液效价达到102.1±0.5,肺灌洗液效价达到102.9。微量中和实验表明重组FLU/RSV/NA-3F减毒活疫苗株能够产生针对RSV的中和抗体,中和效价101.75±0.053;HI实验表明能够产生针对流感病毒的中和抗体,效价达到1:640。检测脾细胞分泌的IFN-γ及IL-4细胞因子显著升高。攻毒后,两组小鼠的鼻肺病毒载量均降低,10⁶TCID₅₀高剂量组小鼠鼻组织中的病毒载量为101.147±0.02,小鼠肺组织中的病毒载量为102.181±0.02。小鼠体重无明显变化、肺部无明显病理变化,IL-4细胞因子无明显升高,没有出现ERD症状。被动免疫中,小鼠肺组织研磨液中的病毒载量为103.1±0.015（P<0.01）。结论:成功制备重组嵌合FLU/RSV/NA-3F减毒活疫苗。动物试验证明重组嵌合FLU/RSV/NA-3F减毒活疫苗能够有效刺激小鼠机体产生粘膜免疫、细胞免疫及体液免疫应答,能够产生中和抗体,证明重组嵌合FLU/RSV/NA-3F减毒活疫苗具有良好的免疫原性。攻毒试验证明重组嵌合FLU/RSV/NA-3F减毒活疫苗具有良好的免疫保护效果。被动免疫实验证明免疫血清在减少RSV肺中的复制、肺组织病变方面发挥作用。通过制备RSV F NPs疫苗和重组嵌合FLU/RSV/NA-3F减毒活疫苗,探索RSV疫苗的有效形式,达到高效的免疫原性和免疫保护效果,并力求解决Th1/Th2不平衡等问题,为RSV疫苗候选株提供有力数据。