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青风藤(Sinomenium acutum)又有枫风藤、青藤、滇防己等之称,它是一种传统中药,也被认为是一味重要的名族药,用青风藤来治疗类风湿性关节炎以及其他相似疾病已经延续了一千多年。近年来,药企和公司大量收购青风藤,青风藤野生资源的损坏程度极为严重,其种群数量急剧下降。本研究旨在一步步推测出青藤碱生物合成的完整通路,并对通路中可能起到关键调控作用的基因进行挖掘与验证,为后期通过基因工程实现青风藤青藤碱的合成生物学及产业化应用奠定坚实的基础。主要研究结果如下:1、运用分子生物学系统分类把全国各地收集的共63份野生青风藤植株分为了15种cp-DNA单倍型(C1-C15),2018年挑选三年生15个cpDNA单倍型青风藤植株(根和茎均取),进行转录组测序,建立了青风藤转录组池库。结果显示:测序共获得108.95Gb Clean Data,每个样品的Clean Data都达到6 Gb以上,满足分析要求,Q30碱基比≥92.98%;共拼接得到363104个转录本,其中包括281923个Unigene;根据转录组测序得到的异喹啉生物碱KEGG通路图,发现青风藤内一共注释到247个基因在这条通路上,推测的青藤碱合成通路中的各种酶在KEGG通路相应位置都能够注释到。2、利用LC-Q-TOF-MS技术对青风藤植株中的生物碱成分进行分析和鉴定,发现在青风藤内存在异喹啉生物碱生物合成途径中共同合成部分的8种生物碱,即从酪氨酸到(S)-网状番茄枝碱这一系列合成途径中的生物碱。另外还存在1,2-去氢网状番荔枝碱、(R)-网状番荔枝碱、萨卢它定、8,14-二氢萨卢它定、O-去甲基青藤碱和青藤酮等关键物质。3、通过代谢组和转录组数据推测出了一条青藤碱生物合成途径。我们推测的青藤碱合成通路前半段符合异喹啉类生物碱合成通路的共同合成步骤,即由酪氨酸开始到合成网状番荔枝碱,再经过一系列反应生成萨卢它定,直到萨卢它定这一步以上的反应均有文献报道,推测后续反应,由萨卢它定经DBR酶催化生成8,14-二氢萨卢它定,再经SNOD酶的作用生成去甲基青藤碱,之后通过ISO酶催化生成青藤酮,最后在OMT酶的催化下生成青藤碱。4、利用高效液相色谱法对3年生的15种cpDNA单倍型所有青风藤植株(根和茎均取)进行青藤碱含量测定。结果发现,每个单倍型内,不同编号青风藤材料的根部位青藤碱含量无显著性差异;不同单倍型之间,C3单倍型与C7单倍型的青藤碱含量平均值显著性差异最大。63份青风藤材料中,青藤碱含量最高的为陕15号(cpDNA单倍型C3),青藤碱含量最低的为贵1号(cpDNA单倍型C7)。选取陕15号与贵1号青风藤植株的根、茎进行转录组测序,结果显示:测序共获得89.42 Gb Clean Data,每个样品的Clean Data都达到6Gb以上,满足分析要求,Q30碱基比≥94.03%;共拼接得到355201个转录本,其中包括275491个Unigene;HR/LR及HS/LS两组中富集在异喹啉生物碱生物合成通路上的差异基因数分别为28个和45个,在HR/LR组中,大部分差异基因主要富集在异喹啉生物碱生物合成途径的上游,即从该合成途径的原料物质酪氨酸到合成网状番荔枝碱这一过程。另外,在从酪氨酸到合成去甲乌药碱这一物质之间的合成途径中,有4个关键酶的位置上存在差异表达基因表达显著上调的情况。在HS/LS组中,异喹啉生物碱生物合成途径富集情况与HR/LR组基本一致。挑选4个关键酶位置上的差异表达倍数大的4个差异基因,分别为:ast、cnmt-1、aoc-1及tydc-1。5、运用荧光定量PCR技术,在用于转录组测序的陕15号和贵1号青风藤材料的根、茎部位中对ast、cnmt-1、aoc-1及tydc-1 4个基因的表达量进行分析,结果发现,青藤碱含量高的材料(陕15号)中基因的相对表达量也高,反之,青藤碱含量低的材料(贵1号)中基因的相对表达量低,可见该4个基因的表达量与青藤碱的含量呈正相关。