原发性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是世界范围内发病率最高的恶性肿瘤之一,在我国每年约有1O万人新患此病,其死亡率在我国恶性肿瘤中居第二位。目前手术切除仍是治疗肝癌的首选方法,但术后复发率高,远期疗效不明确,治疗颇为棘手。近年来,随着综合治疗概念的确立,中医药积极参与肝癌的临床防治,有计划地与手术治疗、放疗、化疗相结合,可明显减少不良反应,使肝癌总体疗效得到了进一步提高。清肝化瘀方药为姚树坤教授根据祖国传统医学理论和多年临床经验研制的治疗肝癌的经验方,该方以解毒利湿、破瘀散结、健脾行气为法则,以往临床和动物实验已证实对肝硬化、肝癌有明显的阻断作用,可从多环节、多靶点抑制肿瘤形成和进展。目前公认的肿瘤发生模式是多基因突变、多因素、多途径、多步骤的过程,在此过程中一些重要的生长因子及其受体通过信号转导通路控制着细胞的增殖、分化、发育、凋亡等所有活动。细胞信号传导异常,会导致肿瘤快速增殖、无限生长。随着分子肿瘤学、分子药理学的发展,信号传导在肿瘤形成过程中的作用正在逐步被阐明,信号传导通路已成为抗肿瘤药物研究的新靶点。最新研究发现Notch信号传导通路在许多肿瘤的发生中发挥重要作用,但关于其对肝癌及肝癌前病变期作用的报道尚不多见。近年来,肝癌前病变期的特殊病理改变逐渐引起了国内外学者的注意,发现此阶段虽然细胞形态尚未发生明显改变,但已出现一些酶学及蛋白表达异常,这些细胞在某些因素持续作用下可发生癌变,故深入研究此阶段的病理机制,为早期干预逆转这种初始病变、阻断肝癌形成提供了理论依据。为此,本研究应用酶组织化学、免疫组织化学、免疫细胞化学、RT-PCR等技术研究了肝癌前病变的一些基本病理改变及Notch信号通路的变化,观察了清肝化瘀方药对肝癌前病变的阻断作用及对Notch信号通路的调节作用,同时应用血清药理学方法,探讨了清肝化瘀方含药血清诱导大鼠肝卵圆细胞WB-F344细胞向成熟肝细胞定向分化的作用,推测此作用可能是通过调节Notch信号通路实现的。第一部分清肝化瘀方药对大鼠肝癌前病变的阻断作用目的:观察大鼠肝癌前病变的形态学、细胞超微结构、酶学、蛋白表达的改变,了解肝癌前病变期的基本病理改变以及清肝化瘀方药对肝癌前病变的阻断作用。方法1. 90只大鼠随机分为4组:A:模型组;B:清肝化瘀方药等效剂量组;C:清肝化瘀方药大剂量组;D:苦参碱组;E组:正常对照组。A、B、C、D组采用腹腔注射二乙基亚硝胺(Diethylnitrosamine,DEN)+2/3肝切除方法复制大鼠肝癌前病变模型,B、C、D组同时分别给予不同剂量清肝化瘀方药和苦参碱灌胃,7周末实验结束。2.应用苏木素-伊红(Hematoxin eosin,HE)染色观察各实验组大鼠肝组织形态学改变;透射电镜观察病变细胞超微结构改变;酶组织化学观察各组肝组织γ-谷氨酰转肽酶( Glutamyl - transpeptidase ,γ-GTase)、三磷酸腺苷酶(Adenosine triphosphatase , ATPase)、葡萄糖-6-磷酸酶(Glcose-6-phosphatase , G-6-Pase)分布及定量比较;免疫组织化学观察各组Thy-1(CD90)、白蛋白( Albumin , ALB )、甲胎球蛋白(Alpha-fetoprotein , AFP)分布及定量比较。结果1. HE染色:7周末模型组大鼠肝小叶结构消失,汇管区小胆管增生,沿小胆管外侧可见卵圆细胞大量增生,有的卵圆细胞以汇管区为中心向肝实质内爬伸样生长,破坏邻近肝板;B、C、D组肝小叶结构存在,可见少量变异肝细胞,卵圆细胞增生较少,C组病理改变最轻。2.透射电镜:卵圆细胞可分为三型,从Ⅰ型到Ⅲ型细胞体积逐渐增大,胞内细胞器逐渐丰富,细胞内的张力微丝及细胞间的桥粒联接为卵圆细胞的特征性结构。3.酶组化染色:γ-GTase:A组可见多处位于汇管区周围或肝小叶内鲜艳的椭圆形玫瑰红色阳性反应灶。B、C、D组病灶着色明显较淡,病灶范围小,A、B、C、D组单位面积内病灶面积为(mm2/cm2,单位下略):8.24±0.53、4.39±0.48、3.16±0.53、3.25±0.47,B、C、D组有明显抑制γ-GT酶变灶的作用(P <0.05或P <0.01), C、D组较B组作用更明显(P<0.01),C、D组之间无显著差异(P >0.05)。ATPase、G-6-Pase:A组均可见到位于肝小叶内的椭圆形阴性反应灶,B、C、D组病灶范围均缩小。4.免疫组化染色:E组中Thy-1、AFP蛋白表达阴性,A组Thy-1、AFP蛋白在汇管区或肝小叶内高表达,B、C、D组表达下调;ALB在E组肝组织中均匀弥漫阳性表达,在A组中表达明显减少,B、C、D组表达上调,A-E组光密度值分别为:Thy-1:150.49±9.45、135.16±6.15、103.83±3.72、102.70±7.75、79.19±6.32;AFP :130.34±10.50、113.38±8.20、89.29±7.05、84.94±5.08、62.82±7.00;ALB :108.79±9.31、130.50±12.36、157.47±6.81、159.86±9.74、186.84±9.75。B、C、D组与A组比较有明显差异(P <0.05或P <0.01),C、D组较B组作用更明显(P <0.01),C、D组之间无显著差异(P >0.05)。结论1.大鼠肝癌前病变阶段具有典型的病理改变特点,卵圆细胞大量增生为特征性改变,清肝化瘀方药和苦参碱可减轻上述病变。2.根据酶组化染色结果推测肝癌前病变机理为细胞氨基酸分子转运及合成过度活跃、Ca2+内流、糖代谢紊乱等,而清肝化瘀方药及苦参碱可能是通过抑制病变细胞氨基酸的过度转运合成、抑制Ca2+内流、稳定糖代谢等机制起到阻断癌前病变作用的。3.根据免疫组化染色结果推测在肝癌前病变期出现大量具有原始干细胞特性的细胞,这些细胞表达某些肝癌细胞的特征,清肝化瘀方药和苦参碱可能具有诱导某些原始干细胞向成熟肝细胞发育分化的作用。第二部分清肝化瘀方药对肝癌前病变大鼠Notch信号通路的影响目的:了解大鼠肝癌前病变期Notch信号分子的蛋白、基因表达情况以及清肝化瘀方药对Notch信号分子的调节作用,探讨Notch信号通路对肝癌前病变的作用以及清肝化瘀方药阻断肝癌前病变的分子机制。方法1.实验分组同第一部分,免疫组化方法观察各实验组肝组织Notch1受体Jagged1配体蛋白定位、定量表达情况。2.半定量逆转录-聚合酶链式反应(Reverse transcription- polymerase chain reaction ,RT-PCR)方法观察各实验组肝组织AFPmRNA、ALBmRNA、Notch1mRNA、Jagged1mRNA、RBP-JκmRNA、Hes-1mRNA表达情况。结果1. Notch1蛋白在E组肝组织细胞膜及胞浆内均匀一致少量表达,A组可见汇管区周边及肝小叶内增生灶中强阳性表达;Jagged1蛋白E组肝组织为肝窦内皮细胞胞膜及胞浆深棕色阳性反应,分布均匀,A组肝小叶内增生灶中可见浅棕黄色反应区域,二者经清肝化瘀方药及苦参碱干预后阳性区域的面积及着色深度均有不同程度减少。A-E组光密度值分别为:Notch1:181.15±8.39、167.55±6.34、131.44±10.08、124.33±6.55、83.17±8.74;ALB:150.33±9.35、135.29±9.89、109.27±11.65、105.16±8.88、75.58±8.73, B、C、D组较A组明显下降(P<0.05或P<0.01), C、D组之间无显著差异(P>0.05)。2. A组中AFP mRNA、Notch1mRNA、JaggedmRNA、RBP-JκmRNA、Hes1mRNA表达最强,ALB mRNA表达最弱;E组中ALB mRNA表达最强, AFPmRNA、Notch1mRNA、JaggedmRNA、RBP-JκmRNA、Hes1mRNA表达最弱;B、C、D组干预后AFPmRNA、Notch1mRNA、JaggedmRNA、RBP-JκmRNA、Hes1mRNA表达较A组减弱(P<0.05或P<0.01),ALBmRNA表达较A组增强(P<0.05或P<0.01),C、D组之间无显著差异(P>0.05)。结论:在肝癌前病变期Notch信号通路各分子蛋白及基因均高表达,经清肝化瘀方药和苦参碱干预后表达逐渐减低,提示清肝化瘀方药和苦参碱可能是通过调节Notch信号通路起到阻断肝癌前病变作用。第三部分清肝化瘀方含药血清对大鼠肝卵圆细胞WB- F344细胞增殖及Notch信号通路的调控作用目的:了解在体外培养的大鼠肝卵圆细胞株WB F-344细胞上Notch信号的表达情况及清肝化瘀方含药血清对WB F-344细胞表达Notch信号分子的调节作用,探讨清肝化瘀方含药血清对该细胞分化发育的影响。方法1.含药血清的制备及分组:各组动物造模及给药方法同第一部分,7周末给药后2h麻醉动物,下腔静脉无菌取血,分离血清,抽滤除菌,-80℃冻存备用。A:肝癌前病变模型组血清;B:清肝化瘀方含药血清;C:苦参碱含药清; D:正常大鼠血清对照组。2. MTT法检测清肝化瘀方含药血清和苦参碱含药血清对WB F-344细胞株增殖影响。3.免疫细胞化学方法检测清肝化瘀方含药血清和苦参碱含药血清对WB F-344细胞表达AFP、ALB、Notch1蛋白的影响。4、RT-PCR检测清肝化瘀方含药血清和苦参碱含药血清对WB F-344细胞表达AFPmRNA、ALBmRNA、Notch1mRNA、HES1mRNA的影响。结果1. A组血清可促进WB- F344细胞增殖,5%、10%、20%浓度的B、C组血清作用于WB- F344细胞24h、48h、72h均有不同程度的抑制增殖作用,同一浓度的B、C组血清随时间延长药物对WB F-344细胞增殖的抑制率逐渐增加,同一时间点B、C组血清随浓度增加该药对WB F-344细胞增殖的抑制率逐渐增加,提示二种含药血清对WB F-344细胞增殖的抑制作用存在时间、剂量依赖性。2. D组血清培养的WB- F344细胞胞浆表达AFP、Notch1蛋白,不表达ALB蛋白;经A组血清干预后AFP、Notch1蛋白表达增强,ALB蛋白仍不表达;经B、C组血清干预后细胞表达AFP、Notch1蛋白减弱,并出现ALB蛋白表达。A-D组光密度比值分别为:AFP:113.17±14.25、54.50±8.97、73.06±6.26、35.95±4.83;Notch1:84.97±6.41、45.81±4.77、61.50±50.43、33.20±3.60,AFP、Notch1蛋白表达:B、C、D组较A组明显下降(P <0.01),B、C组有显著差异(P <0.01)。ALB表达为:B组:46.45±6.92、C组:38.64±4.33,B、C组有显著差异(P<0.01)。3. D组血清培养的WB-F 344细胞AFPmRNA、Notch1mRNA、Hes1mRNA为弱表达,ALBmRNA不表达;A组血清培养的细胞AFPmRNA、Notch1mRNA、Hes1mRNA表达明显增强(P<0.01),ALBmRNA不表达;经B、C组血清培养的细胞AFPmRNA、Notch1mRNA、Hes1mRNA表达较D组减弱(P<0.01),ALBmRNA有较弱表达,且B、C组有显著差异(P<0.01)。结论1.清肝化瘀方药含药血清和苦参碱含药血清有抑制WB F-344细胞增殖的作用,清肝化瘀方药含药血清较苦参碱含药血清作用更明显。2.清肝化瘀方药含药血清和苦参碱含药血清可下调WB F-344细胞Notch信号分子、AFP的蛋白及基因表达,诱导ALB蛋白及基因表达,清肝化瘀方药含药血清较苦参碱含药血清作用更明显。推测清肝化瘀方药含药血清和苦参碱含药血清能诱导WB F-344细胞向成熟肝细胞方向分化,与下调Notch家族信号分子有关。