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目的:探讨骨髓间充质干细胞上清(MSC-CM)对2,5-己二酮(HD)染毒VSC4.1细胞过度自噬的拮抗作用及其机制。方法:取3到4周龄的SD大鼠股骨、胫骨提取MSC-CM,贴壁并纯化培养,提取上清,并将其按照1:10比例进行浓缩。VSC4.1细胞分为五组:(1)对照组:DMEM培养24小时。(2)染毒组:25 mM的HD染毒24小时。(3)MSC-CM组:染毒后弃去培基,加入含5%、10%、15%(v/v)间充质干细胞上清的DMEM继续孵育24小时。(4)NGF组:染毒后弃去培基,加入100 ng/mL的NGF孵育24小时。(5)抑制剂组:染毒后弃去培基,分别加入NGF、TrkA、PI3K、mTOR的抑制剂对细胞进行预处理,随后加入15%上清孵育24小时。MTT检测细胞活性,LDH检测细胞死亡;ELISA法测定上清中NGF的浓度;荧光染色法检测VSC4.1细胞中LC3及NGF的表达;透射电镜观察自噬小体和自噬溶酶体;Western Blot检测VSC4.1细胞中LC3、p62、TrkA、p-TrkA、mTOR、p-mTOR、ULK1、p-ULK1的表达。使用SPSS17.0统计软件,对实验结果进行统计学分析。结果:1.MSC-CM对HD暴露VSC 4.1细胞自噬的影响LC3-DAPI染色发现HD组LC3表达较对照组增加(P<0.05),MSC-CM组的LC3表达则较HD组降低,且呈剂量依赖性(P<0.05)。电镜观察发现HD组自噬小体及自噬溶酶体增加,MSC-CM组中随着上清浓度的增加,自噬小体及自噬溶酶体的数量逐渐减少(P<0.05)。HD组LC3Ⅱ/Ⅰ的比值增加、p62表达下降,MSC-CM组LC3Ⅱ/Ⅰ的比值较HD组降低、p62表达增加(P<0.05)。2.MSC-CM对HD暴露VSC 4.1细胞活力的影响HD染毒降低了VSC4.1细胞的活性,导致死亡率增加,在加入MSC-CM后细胞活性增加,死亡率降低。在加入自噬拮抗剂及MSC-CM后,细胞死亡率较HD组明显降低(P<0.05)。3.NGF含量和MSC-CM对TrkA及其磷酸化蛋白表达影响免疫荧光结果表明HD染毒组NGF表达较对照组明显降低(P<0.05),MSC-CM组NGF表达较HD组明显增多,呈剂量依赖性(P<0.05)。HD组p-TrkA的表达量减少(P<0.05),MSC-CM组p-TrkA表达量逐渐增加,呈剂量依赖性(P<0.05)。4.NGF对MSC-CM抗细胞自噬作用的影响与MSC-CM组相比较,加入NGF抑制剂组的LC3表达量明显增加(P<0.05),且LC3Ⅱ/Ⅱ的比值显增加、p62的表达降低、自噬小体及自噬溶酶体的数量显著增加(P<0.05),自噬活性增强。5.MSC-CM对PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响HD组及抑制剂组p-Akt、p-mTOR表达降低,MSC-CM组p-Akt、p-mTOR表达增加。6.MSC-CM对HD暴露VSC4.1细胞ULK1及其磷酸化蛋白表达的影响HD组及抑制剂组p-ULK1的表达量较对照组明显减少(P<0.05),MSC-CM组中p-ULK1表达较HD组增加(P<0.05)。7.NGF介导/PI3K/Akt/mTOR通路调控MSC-CM抗自噬作用与HD染毒组相比,MSC-CM处理后LC3表达量降低、自噬小体及自噬溶酶体减少、LC3Ⅱ/Ⅰ比值降低、p62表达增加。在MSC-CM及NGF中加入抑制剂后,LC3表达量增多、自噬小体及自噬溶酶体增加、LC3Ⅱ/Ⅰ比值增高、p62表达降低。结论:MSC-CM拮抗HD暴露的VSC4.1细胞自噬;MSC-CM的抗自噬作用与NGF有关;MSC-CM通过NGF激活PI3K/Akt/mTOR信号通路,拮抗HD诱导的过度自噬。