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目的:构建特异性表达Her-2的慢病毒载体,探索慢病毒颗粒转染DCs后诱导淋巴细胞活化增殖能力和其抗肿瘤免疫应答效应,并对比其与单纯DCs诱导CIK杀伤Her-2阳性肺癌的能力差异。方法:1.构建表达Her-2基因的慢病毒载体:以pcDNA3.1-ERBB2-EGFP为模板,设计含Not I和Xba I酶切点引物,PCR法扩增ERBB2基因片段,T4连接酶连接慢病毒制备表达Her-2基因的慢病毒质粒,感受态细胞单克隆复制挑选表达Her-2基因的慢病毒,PCR法鉴定克隆产物的正确性,293T细胞进行慢病毒包装,36h后收集上清液即可获得表达Her-2的慢病毒载体颗粒,密度梯度稀释法检测病毒滴度。2.制备表达Her-2蛋白的DC疫苗:收集人外周血液单个核细胞,通过IL-4,GM-CSF等细胞因子定向诱导,制备DCs。在DCs培养第5天分别加入携带Her-2基因慢病毒载体和空载体进行转染(MOI=10),第6天加入肿瘤坏死因子α刺激成熟,第8天收集DCs。显微镜下查看病毒感染DCs后绿色荧光呈现情况,流式细胞仪检测慢病毒载体转染后成熟DCs表面CD1α/83/86和HLA-DR表达情况,并与传统单纯DCs和空载体DCs进行比较。3.检测淋巴细胞增殖情况:利用CD3、IL-2等因子体外诱导培养外周血单个核细胞,制备CIK疫苗。当培养至第8日时,分别与LV-Her2-DCs、LV-DCs和单纯DCs共培养,以刺激CIK增殖活化。流式细胞仪检测CIK表面CD3/56表达情况,酶标仪检测450nm下OD值,判断三组CIK增殖情况。4.体外杀伤肿瘤细胞:免疫组化挑选一株表达Her-2的肺癌细胞,将三组DC-CIK和Her-2阳性肺癌细胞分别以10:1、20:1、40:1的效靶比共培养杀伤48小时,CCK8法检测三组DC-CIK疫苗的杀伤能力。结果:1.成功构建编码Her-2基因的慢病毒载体,显微镜下可见293T细胞呈现绿色荧光,提示目的基因转入靶细胞。病毒滴度为:2 x 108TU/ml。2.成功培养特异性表达Her-2的DC疫苗,当MOI=10时,空载体病毒和含Her-2基因的慢病毒转染DC后细胞表面绿色荧光蛋白表达率分别为40.2%和41.8%,两组DC感染率无明显差异(p=0.293),提示携带Her-2基因并不影响慢病毒转染能力。DCs表面CD1α/83/86和HLA-DR表达量提示DC成熟,转染病毒后不影响DC分化成熟能力。3.成功从外周血中获取单个核细胞进行CIK培养,显微镜下观察细胞呈悬浮生长,易集群,流式细胞仪检测提示三组CIK表面CD3/56因子均有表达,LV-Her2-DC诱导CIK活化增殖能力约为LV-DC或单纯DC的2倍(p=0.00)。其中,LV-DC和单纯DC诱导CIK增殖能力无明显差异(p=0.06),LV-Her2-DC诱导CIK增殖能力与单纯DC对照组相比较具有明显的统计学差异(p=0.007)。4.免疫组化结果证实A549肺癌细胞株呈弱且不完整的胞膜着色;应用CCK8试剂盒检测LV-Her2-DC-CIK实验组在以10:1、20:1、40:1的效靶比对A549肺癌细胞株的杀伤能力,杀伤率依次为:26.9%、43.8%、52%。明显高于单纯DC-CIK对照组的杀瘤率(p<0.05),而LV-DC-CIK空载体组与单纯DC-CIK对照组的杀瘤率相比无统计学差异(p>0.05)。结论:1.本研究构建重组Her-2基因片段的慢病毒载体能够有效转染DCs。2.LV-Her2-DC诱导CIK增殖活化能力明显增强。3.LV-Her2-DC-CIK实验组对Her-2阳性的A549细胞株具有明显的杀伤能力。4.本研究制备的LV-Her2-DC疫苗对Her-2阳性肺癌可能是一种有效的治疗方式,为肺癌患者的个体化精准治疗提供了一定的实验和理论基础。