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胆盐水解酶(EC 3.5.1.24)能够将脊椎动物体内的结合态胆盐水解成游离态的胆盐和氨基酸,从而导致肝脏细胞由胆固醇从头合成结合胆盐,起到降低机体内的血清中的胆固醇水平的作用。胆盐水解酶因其可以降低血清中胆固醇水平,预防心血管疾病而成为国内外研究的热点之一。然而,关于胆盐水解酶基因的高效表达和酶学性质的研究较少,此外,酶催化反应时与底物之间的作用机理尚不明确。本文将双歧杆菌来源的胆盐水解酶基因在大肠杆菌中高效表达,并利用镍亲和层析对重组酶进行分离纯化和酶学性质分析,最后对重组酶进行底物特异性改造。主要研究结果如下:将PCR获得的胆盐水解酶基因克隆至表达载体p ET-22b(+),得到重组质粒p ET-22b(+)-bsh并转化大肠杆菌BL21(DE3)。经发酵优化,种子液以2%转接发酵培养基,重组菌在20°C、OD600 2.0、IPTG 1 mmol?L-1条件下诱导32 h可达最高酶活,对甘氨脱氧胆酸钠和牛磺酸脱氧胆酸钠的酶活分别为135.2和121.3 U?m L-1。采用镍亲和层析柱对重组胆盐水解酶进行纯化,经SDS-PAGE分析,胆盐水解酶相对分子质量(Mr)为35.0×103。酶学性质研究表明,重组胆盐水解酶偏好水解甘氨结合胆盐,对甘氨胆酸钠的催化活性为220.1 U?mg-1。重组胆盐水解酶在4-37°C范围内的热稳定性较好,孵育30 min,残留酶活95%以上。金属离子对重组胆盐水解酶的活性有一定的激活和抑制作用。酶催化反应的动力学参数经Hill方程拟合,希尔系数大于1,表明底物与酶之间存在协同作用,且不同底物与重组胆盐水解酶之间存在不同的协同作用,表明重组胆盐水解酶属于变构酶。对双歧杆菌来源胆盐水解酶氨基酸序列同源比对分析,选择E60位点饱和突变。以p ET-22b(+)-bsh为模板,对60位的谷氨酸进行饱和突变,通过测定突变体的酶活发现,突变体E60Y、E60A、E60F、E60I、E60V和E60D对甘氨结合胆盐和牛磺结合胆盐的水解活性都有一定的提高,且底物特异性也有一定改变。突变体E60Y与野生胆盐水解酶相比,对甘氨结合胆盐和牛磺结合胆盐的水解活性分别提高了2.62倍和1.96倍,达到576.66 U?mg-1和301.98 U?mg-1。分析突变体催化反应的动力学参数,突变体催化效率的提高可能是导致酶活升高的主要原因。