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超氧化物歧化酶（SOD）是一种金属酶。根据其活性位点结合的金属离子不同，SOD可分为CuZn-SOD、Fe-SOD和Mn-SOD以及最近发现的Ni-SOD。由于SOD可以使超氧阴离子自由基歧化生成过氧化氢和分子氧，从而在防止氧化胁迫方面发挥重要作用。又由于SOD有助于一些病原微生物拮抗寄主氧进发所产生氧自由基的杀伤作用，所以SOD被认为有助于一些胞内病原菌的侵入与定殖，是一种致病因子。 蜡质芽孢杆菌M22菌株（Bacillus cereus M22）是本研究室从甜菜体内分离的、对多种植物病害具有良好防治效果的生防细菌。M22代谢液及胞内SOD含量较高，推测SOD可能在M22侵染宿主过程中以及在病害防治中发挥重要作用。本研究应用分子生物学技术克隆M22菌株中全部SOD基因，并在大肠杆菌（Escherichia coli）或毕赤酵母（Pichia pastoris）中对其进行了表达和功能的初步分析。主要研究结果如下： 1 蜡样芽孢杆菌M22锰超氧化物歧化酶基因的克隆及原核表达 通过PCR技术，从蜡样芽孢杆菌M22基因组DNA中扩增到1317bp的基因序列，GenBank登录号为AY540749。该片段所含的开放阅读框长657hp，编码218个氨基酸残基的酶蛋白。此蛋白同其它种属Mn-SOD具有很高同源性，且保守氨基酸残基类型及位置均与其它来源Mn-SOD相同，可确定所得片段为蜡样芽孢杆菌编码Mn-SOD的基因。将Mn-SOD基因的读码框插入载体pET-22b（+）构建表达质粒pET-sodA，转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导后进行SDS-PAGE，结果显示融合蛋白相对分子质量为28kD。将表达质粒转入SOD缺陷型大肠杆菌QC779，赋予了该菌株对paraquat的抗性。活性电泳及酶活性测定结果均表明Mn-SOD基因得到正确表达。 2 蜡样芽孢杆菌M22铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆及在E．coli中表达 采用PER技术，从蜡样芽孢杆菌M22基因组DNA扩增到长1320bp的基因片段。该片段含编码179个氨基酸残基的开放阅读框，推定蛋白序列与报道的CuZn-SOD序列有很高同源性，其中N端16个氨基酸残基推定为信号肽序列。将CuZn-SOD编码区插入表达载体pET-22b（+），转化E．coli BL21（DE3），IPTG诱导融合蛋白表达。SDS-PAGE显示，融合蛋白表观分子质量约24kD，融合蛋白占菌体裂解液中总蛋白的21.3％。将此表达载体转入SOD缺陷型大肠杆菌PN132，赋予了该菌株对Paraquat的抗性。NBT光抑制法测定SOD活性显示，与PN132无SOD活性相比，重组子在IPTG诱导前SOD活性极低（1.79U／mg），诱导后活性高达69.76U／mg。非变性电泳结果显示，该酶活性不同程度的受到5mmol／L H2O2和5mol／L KCN的抑制。浙江大学博士学位论文中文摘要3.蜡样芽抱杆菌拟2基因组文库的构建及铁超氧化物歧化酶基因片段的克隆 以具有抗病、促生作用的植物内生蜡样芽抱杆菌祀2为材料，制备其基因组总DNA，经限制性核酸内切酶Sa此Al部分酶切后，在T。ONA连接酶作用下与经及园1工完全酶切、去磷酸化的粘粒pZLI连接后进行包装。取少量包装产物转化云co1z’ DH5a，从理论上推知该文库容t为31，7oopfu/m1。取100泌包装产物转染SOD缺陷型大肠杆菌QC779，筛选能够在含10林皿01/L Par叙luat的LB平板（含5恤g/L恤p和2恤g/L Kan）上生长的菌落。经醉切验证显示，重组质粒含有约4Okb大小的外源片段。将重组菌株的超声破碎液进行活性聚丙烯酞胺凝胶电泳，发现在深蓝色背景下有透明的单一活性条带出现，经验证为Fe一SOD.根据Fe一SOD序列的保守位点合成简并引物，以重组质粒为模板进行PCR，结果扩增到长414bp的基因片段，GenBank登录号为AY378171。该片段编码的138个氨基酸残基的肤段同其它种属Fe一SOD具有很高同源性二且保守氨基酸残基类型及位置均与其它来源F二SOD相同，可确定扩增片段为蜡样芽胞杆菌F，SOD基因核心区。4.蜡样芽抱杆菌盗2铜锌超氧化物歧化酶基因在毕赤酵母中的分泌表达 根据已经克隆的蜡样芽抱杆菌Cuzn一SOD的基因序列，设计特异引物，扩增Cuzn--SOD的编码框序列。扩增产物经相应内切酶消化后与用同样酶消化的醉母分泌型表达载体pPIcZ以连接，转化大肠杆菌DH5a。利用限制性内切酶对在Zeooin平板上生长的转化子进行酶切鉴定，然后将阳性转化子线性化后电激转化酵母GS 115的感受态细胞。对能够在Z。。c in抗性平板上生长的菌落利用特异引物和通用引物进行PCR鉴定，筛选出阳性克隆，用甲醉诱导阳性克隆的外源基因表达。结果发现，甲醉诱导表达的外源基因的产物具有生物学活性，在诱导后的上清液中，表达蛋白的活性达到35U/ml。 氧进发产生活性氧是多数植物拮抗病原徽生物的机制之一，而微生物的s0D在防止活性氧对其杀伤中起重要作用。目前，我们对SOD在内生细菌俊染寄主过程中如何拮抗活性氧伤害的机理还一无所知.克隆SOD基因只是理解Son在内生菌侵染过程作用的第一步，仍有很多工作巫待进一步深入研究