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研究背景和目的:胃癌是消化系统最常见的肿瘤之一,其早诊率低、恶性程度高、发生转移早是造成胃癌预后差的可能原因。目前传统的放化疗效果对延长胃癌的生存结果有限,且临床常用的CEA、CA-724、CA-199等肿瘤标志物对早期胃癌诊断缺乏明显意义。因此探索新的胃癌早诊标志物及其信号通路中的有效靶点,成为帮助患者延长生存的方法。Micro RNA(miRNA)作用于下游靶点,参加涵盖肿瘤细胞发生、转移及血管生成等,且外周血miRNAs的种类及表达水平在正常人及肿瘤患者或其他疾病状态下存在显著差异。结合本课题组的前期研究结果,我们发现胃癌患者血清miR-26a/b与正常人存在明显差异,但其具体的调控机制仍在探索中。本课题旨在通过研究miR-26a/b与患者临床病理特征的关系及对胃癌的诊断价值,进而探讨miR-26a/b影响胃癌细胞增长可能的通路及潜在机制。研究内容及方法:1.临床水平实验:胃癌患者血清miR-26a/b的表达水平与临床病理特征的关系及对胃癌的诊断价值。(1)随机抽取2016年4月至10月就诊于天津医科大学肿瘤医院的121例胃腺癌患者及116例健康人的外周血标本。121例胃腺癌患者均为初诊,无任何治疗,其中男性58例,女性63例,中位年龄(63.5±10.0)岁。116名健康志愿者中,有男性66例,女性50例,中位年龄(35.8±7.1)岁;排除肿瘤性疾病。接下来按照说明书提取血清及总RNA,并利用qRT-PCR检测两组血清中miR-26a/b的表达水平。(2)根据统计学方法,分析血清miR-26a/b与胃癌患者临床病理特征的关系。(3)制作ROC曲线,评价血清miR-26a/b对胃癌的诊断价值。2.组织水平实验:验证胃癌组织中miR-26a/b的表达,并发掘下游的基因靶点。(1)从以上121例胃腺癌患者中选取16对术后胃腺癌组织及其配对的癌旁正常组织,用Taqman探针法检测miR-26a/b表达水平。(2)通过生物信息学软件的方法发现miR-26a/b下游靶向作用于HGF。(3)用Western Blot及RT-qPCR检测16对胃腺癌组织及其配对的癌旁正常组织组织中HGF的表达,明确miR-26a/b与HGF的负向调控关系。3.体外细胞实验:miR-26a/b-HGF-VEGF信号通路对胃癌细胞系生物学行为的影响。(1)HGF可介导VEGF的表达,上调或下调MGC-803胃癌细胞中miR-26a/b的表达,验证对HGF及VEGF的调控作用。(2)采用细胞功能学实验(Edu、Transwell及划痕实验)探究miR-26a/b影响胃癌细胞增殖、侵袭等过程。(3)用慢病毒转染过表达HGF及sh RNA下调HGF,验证其对VEGF的作用及对胃癌细胞生物学功能的影响。4.体内动物实验:miR-26a/b-HGF-VEGF信号通路在体内调节肿瘤生长及血管生成。(1)将MGC-803过表达HGF组、MGC-803过表达miR-26a、MGC-803过表达miR-26b组及未经处理的MGC-803细胞分别于裸鼠腋下植瘤。(2)4周后处死小鼠,取出肿瘤。测量肿瘤大小及重量,检测组织中HGF、VEGF、miR-26a/b表达水平及不同组别血管生成的情况。研究结果:1.临床水平实验:通过qRT-PCR对胃癌及正常人外周血miR-26a/b表达水平的检测发现,胃癌患者血清中miR-26a/b的水平明显低于正常人,且miR-26a/b的表达与患者TNM分期、胃癌浸润深度、淋巴结转移情况相关,进一步探讨发现分期越晚的患者,血清中miR-26a/b的表达含量越低,因此miR-26a/b在胃癌中担当“抑癌基因”的角色,可作为预测胃癌患者临床分期及预后差异的潜在生物学指标。最后,通过制作ROC曲线评估血清miR-26a/b的诊断价值,结果证实miR-26a/b的AUC分别为0.828和0.853,具有较高的诊断价值。2.组织水平实验:通过Taqman探针法检测发现,胃癌组织中miR-26a/b含量低于配对的癌旁正常组织,与血清中的结果一致,进一步明确了miR-26a/b“抑癌基因”的作用。经生物信息学软件方法明确miR-26a/b靶向作用于HGF。进一步对胃癌组织中HGF的表达水平检测,结果显示癌组织中HGF明显高于癌旁正常组织,因此miR-26a/b与HGF存在负向调控关系。3.体外细胞实验:在MGC-803细胞中转染miR-26a/b类似物/抑制剂(mimics/inhibitors)后,导致miR-26a/b的表达水平升高或减低。通过Western Blot证明,miR-26a/b表达上调后,HGF及VEGF含量下降;miR-26a/b表达下调后,HGF及VEGF含量增加。RT-qPCR证明HGF m RNA水平无显著改变。细胞功能学实验表明miR-26a/b抑制细胞的扩增及转移。另外在MGC-803细胞中利用慢病毒过表达HGF或转染sh RNA抑制HGF的表达后,VEGF的表达与HGF呈现一致性,且同样影响细胞增殖及侵袭。4.体内动物实验:miR-26a/b过表达组的肿瘤生长明显受到抑制,且HGF及VEGF蛋白表达水平明显下降,而且miR-26a/b通过抑制VEGF的表达,从而减少体内肿瘤血管的形成。研究结论:通过临床实验,我们发掘了miR-26a/b与胃癌患者临床病理特征的关系及潜在的诊断价值。接下来分别从组织水平、体内细胞实验及体外动物实验证实miR-26a/b的可能信号通路,即靶向作用于HGF,通过削弱HGF-VEGF轴的表达,从而抑制胃癌肿瘤细胞的增长、侵袭、转移及血管生成。