中华绒螯蟹(Eroicheir sinensis),俗称河蟹、大闸蟹,是我国重要的水产经济动物。蜕壳是甲壳动物重要的生物学现象,河蟹的生长和再生都是通过蜕壳来完成的。本研究首先对中华绒螯蟹不同蜕壳阶段的肝胰腺组织进行比较转录组分析,在筛选到差异表达基因即蜕皮激素受体基因(ecdysone receptor,EcR)的基础上,聚焦与其具有拮抗作用的蜕皮抑制激素基因(molt-inhibiting hormone,MIH),对这两个基因在蜕壳过程中的时空表达特征及相互调节机制进行了研究。主要研究结果如下:1.中华绒螯蟹蜕壳周期内的基因表达特征研究本实验采用RNA-Seq测序技术对中华绒螯蟹同一蜕壳周期内的肝胰腺转录组进行了分析,共获得了97,398个转录本,注释了31,900个转录本,找到了1,189个差异表达基因。根据这些差异表达基因,我们构建了河蟹一个蜕壳周期内关于能量代谢和生理调控的表达模式图。结果表明,在蜕壳后期,差异表达基因主要与能量消耗有关,该阶段是保持细胞稳态,壳硬化和恢复的阶段;在蜕壳间期,差异表达基因主要集中在碳水化合物合成、脂类代谢和生物合成方面,该阶段主要是能量储存过程,是生长发育的重要阶段;在蜕壳前期,主要是应对激素和类固醇的刺激,为下一次蜕壳进行准备的阶段,高表达的基因主要与脂类合成和免疫发育相关。此外,本实验还利用qPCR技术对12个差异表达基因进行了验证,并发现蜕皮激素受体基因(ecdysone receptor,EcR)在蜕壳前期的表达量显著高于蜕壳后期。本研究通过对河蟹肝胰腺组织进行比较转录组分析,揭示了河蟹蜕壳过程中的能量变化过程,找到了不同蜕壳阶段的差异表达基因,筛选出与蜕壳相关的重要基因,即蜕皮激素受体基因(ecdysone receptor,EcR),为进一步研究河蟹蜕壳机制提供了理论基础。2.中华绒螯蟹内参基因的稳定性评估荧光定量PCR(qPCR)结果的准确性与所选取的内参基因的表达稳定性密不可分。因此,为了获得准确的qPCR结果,通常要对内参基因进行稳定性评估。本实验中,选取了10个常用的内参基因(包括从第二章转录组数据中筛选出来的3个内参基因UBE、α-TUB和β-ACTIN及7个从NCBI上下载的河蟹内参基因AK、GST、HSP90、S27、VATB、GAPDH和Na K),分析其在中华绒螯蟹不同发育阶段、不同组织和不同蜕壳阶段中的表达水平,结合常用的内参评估软件geNorm、NormFinder和Best Keeper对这些内参基因的稳定性进行了评估。结果表明,ubiquitin-conjugating enzyme E2b(UBE)和ubiquitin/ribosomal S27 fusion protein(S27)是最稳定的内参基因;而常用的内参基因glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)和beta-actin(β-ACTIN)在河蟹不同发育阶段的表达稳定性却很差。此外,研究还发现为了获得更为准确的基因表达结果,通常要选取2-3个稳定的内参基因进行校准。为了验证内参基因筛选的准确性,本实验还分别选取不同的内参基因进行校准来分析Ec R基因在不同蜕壳阶段的表达情况。研究发现,当使用最不稳定的内参基因glutathione S-transferase(GST)做校准时,EcR基因在蜕壳前期的表达量显著高于以最稳定的3个内参基因作为校准的结果。本实验筛选出来的内参基因可以用于后续的基因表达研究,同时为其它甲壳动物基因表达研究中内参的选择提供参考依据。3.EcR与MIH基因在中华绒螯蟹蜕壳过程中的时空表达特征分析鉴于有关Ec R与MIH基因的表达研究主要集中在mRNA水平上,而对其蛋白水平的研究较少。本部分实验采用Western blot技术分析了EcR与MIH基因在不同组织及不同蜕壳阶段中蛋白表达情况。结果表明,在蜕壳前期EcR基因的蛋白表达量显著高于蜕壳后期,而MIH基因的蛋白表达水平正好与之相反,其在蜕壳前期显著低于蜕壳后期。MIH蛋白在眼柄组织中高表达,在肌肉和心脏组织中也有表达;EcR蛋白在河蟹的表皮和肌肉组织中大量表达。进一步对EcR和MIH基因进行荧光免疫组化分析,结果发现MIH基因主要在细胞膜和细胞间质中表达,其在蜕壳前期的荧光信号强度显著低于蜕壳后期;EcR基因在蜕壳前期的荧光信号强度高于蜕壳后期,在前期主要表达在细胞核中,在蜕壳后期则主要表达在细胞质中,少量在细胞核中。此外,本实验还采用ELISA方法对河蟹蜕壳周期内的蜕皮激素含量进行了连续测量,结果表明在蜕壳周期内蜕皮激素的含量呈波动性变化,且推测当其含量达到12 IU/mL且持续上升时,河蟹将启动蜕壳。4.EcR与MIH基因的相互调节机制研究本部分实验采用RNAi技术和注射MIH基因的抗体及重组蛋白的方法探讨了EcR与MIH基因的功能互作关系,同时通过沉默EcR和MIH基因,及注射MIH基因的抗体和重组蛋白来观察河蟹蜕壳情况,进一步验证了EcR和MIH基因在河蟹蜕壳中的作用。研究结果表明,通过体内注射双链RNA可以成功地敲减EcR与MIH基因,初步建立了河蟹RNA干扰系统。当敲减EcR基因时,MIH基因的表达量也降低;当敲减MIH基因时,EcR基因的表达量却上升。通过注射MIH基因的抗体和重组蛋白发现,在48h内,注射MIH抗体可以显著降低MIH基因的表达量,在注射12h后EcR基因的表达量显著下降,而24h和48h后EcR基因的表达量又显著上升;在48h内,注射MIH重组蛋白可以显著提高MIH基因的表达量,而EcR基因的表达量却显著下降。本实验研究还发现,敲减MIH基因可以显著加速河蟹蜕壳;而敲减EcR基因会延缓蜕壳,同时增加河蟹的死亡率;注射MIH重组蛋白会导致河蟹蜕壳延迟且大量死亡。