【摘 要】
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目的:1.探究多房棘球蚴囊液（HCF）对小鼠肝AML-12细胞凋亡与自噬的初步研究;2.沉默小鼠肝细胞中DDIT4的表达观察其是否调节凋亡与自噬的变化。方法:1.采用CCK8法筛选合适的HCF浓度后,将小鼠AML-12细胞分为对照组、HCF 0.4 mg/mL组和HCF 0.8 mg/mL组。CCK-8法检测各组小鼠肝AML-12细胞的细胞活性（浓度选择）;流式细胞术检测小鼠肝AML-12细胞凋亡
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目的:1.探究多房棘球蚴囊液（HCF）对小鼠肝AML-12细胞凋亡与自噬的初步研究;2.沉默小鼠肝细胞中DDIT4的表达观察其是否调节凋亡与自噬的变化。方法:1.采用CCK8法筛选合适的HCF浓度后,将小鼠AML-12细胞分为对照组、HCF 0.4 mg/mL组和HCF 0.8 mg/mL组。CCK-8法检测各组小鼠肝AML-12细胞的细胞活性（浓度选择）;流式细胞术检测小鼠肝AML-12细胞凋亡情况;Western blot法检测DDIT4、Beclin-1、Caspase-3、PCNA、LC3等凋亡自噬相关蛋白的表达情况;单丹磺酰尸胺（monodansylcadaverin,MDC）法检测细胞自噬的情况以及透射电镜下观察HCF对小鼠肝AML-12细胞影响后超微结构的影响。2.使用慢病毒沉默AML-12细胞DDIT4后,在HCF的干预下采用CCK-8法检测各组小鼠肝AML-12细胞的细胞活性;Western blot法检测Beclin-1、Caspase-3、LC3等凋亡自噬相关蛋白水平;Tunel法检测细胞凋亡情况。结果:1.CCK-8结果显示在24、48和72h,0.8 mg/mL、1.6 mg/mL、3.2 mg/mL和6.4 mg/mL HCF组与对照组比较以及48h和72h后0.4 mg/mL HCF组能明显抑制AML-12细胞的增殖（P＜0.01）;流式细胞计数检测结果显示0.4 mg/mL、0.8 mg/mL HCF作用于细胞48h后细胞凋亡率明显上升（P＜0.01）;MDC法结果显示0.4 mg/mL、0.8 mg/mL HCF作用于细胞48h后出现大量高亮度类圆形团块,平均荧光强度明显增高（P＜0.01）;Western blot法检测结果显示:与con组相比,0.4mg/mL、0.8mg/mL HCF组DDIT4、PCNA、Caspase-3、Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表达显著升高（P＜0.01）;0.8mg/mL HCF组与0.4mg/mL HCF组的LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白相比表达升高（P＜0.05）。透射电镜下可见:con组胞质未见明显肿胀,线粒体基质较均匀,嵴少量减少,自噬水平低;0.4 mg/mL组线粒体损伤程度较低,轻微肿胀,嵴少量断裂,胞内可见较多自噬溶酶体;0.8 mg/mL组细胞线粒体损伤程度高,线粒体膜破损、基质外溢,嵴缺失,胞内可见较大面积自噬溶酶体。2.在小鼠肝细胞中沉默DDIT4后,在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光强度及被感染细胞数量,荧光细胞占全视野细胞的80%以上。PCR和Western blot结果显示转染后LV-Ddit4-RNAi组中DDIT4基因和蛋白表达水平较LV-Ddit4-NC显著下调（P＜0.01）。CCK-8法显示沉默DDIT4后小鼠肝细胞在0.4 mg/mL、0.8mg/mL HCF 48h后作用下增殖能力明显高于LV-Ddit4-NC（P＜0.01）;显微下观察48h后细胞形态接近正常AML-12细胞形态,多成椭圆形或者圆形,细胞生长密度较LV-Ddit4-NC明显增多;Tunel实验显示沉默DDIT4可明显抑制细胞凋亡的发生（P＜0.01）;Western blot法检测结果显示,与LV-Ddit4-RNAi con相比,LV-Ddit4-RNAi 0.8mg/mL HCF组Caspase-3表达具有统计学意义（P＜0.05）;与LV-Ddit4-NC 0.4mg/mL、0.8mg/mL HCF组相比,LV-Ddit4-RNAi 0.4mg/mL、0.8mg/mL HCF组LC3-Ⅱ表达具有统计学意义（P＜0.05）,Beclin-1、Caspase-3蛋白表达具有统计学意义（P＜0.01）,具有减轻细胞凋亡的发生。结论:1.HCF对体外培养的AML-12细胞的增殖有明显的抑制作用,DDIT4蛋白表达水平增高,并促进AML-12细胞自噬的发生及诱导细胞发生凋亡。2.通过沉默DDIT4可以促进AML-12细胞在HCF作用后细胞的增殖,并抑制AML-12细胞在HCF作用后凋亡和自噬的产生。
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