论文部分内容阅读
犬瘟热（canine distemper,CD）是由犬瘟热病毒（canine distemper virus,CDV）引起的一种病毒性传染病,在全世界范围内广泛发生。其传统宿主主要包括大部分食肉目动物。CDV感染犬科、猫科、浣熊科、鼬科、小熊猫科、大熊猫科已被多次报道。截至2013年年底,全国野生大熊猫种群数量达1864只,圈养大熊猫种群数量达到375只。2014年12月至2015年4月,陕西省珍稀野生动物抢救饲养研究中心22只大熊猫中先后有6只CDV核酸检测阳性,并且5只抢救无效相继死亡。目前,RT-qPCR和胶体金试纸条是犬瘟热最常用的检测手段,但是RT-qPCR成本高、技术复杂、容易污染。而胶体金试纸条大多是针对感染犬的犬瘟热病毒,并没有针对犬瘟热的试纸条。因此,有必要建立一种敏感性强且特异性好的犬瘟热病毒检测技术,从而能够准确、快速地诊断感染大熊猫的犬瘟热病毒,对保护我国珍稀动物有着重大意义。本实验构建了犬瘟热病毒楼观台毒株F蛋白的原核表达质粒,表达了犬瘟热病毒融合蛋白胞外区,以此作为抗原,制备了针对犬瘟热病毒的单克隆抗体,然后用HRP标记单克隆抗体,建立了针对犬瘟热病毒双抗体夹心ELISA方法。其结果如下:1.犬瘟热病毒重组F蛋白的原核表达与纯化参照犬瘟热病毒楼观台毒株F蛋白的基因序列,构建了包含犬瘟热病毒F蛋白胞外区的重组质粒,转化大肠杆菌表达宿主菌BL21（DE3）,在37℃,1 mmol的IPTG的条件下诱导6 h,超声裂解大肠杆菌,然后经过Ni Resin亲和层析,通过SDS-PAGE与Western Blot分析,CDV-F蛋白成功表达,得到预期大小为40 Kda蛋白,并且表达的CDV-F蛋白具有良好的反应原性,用经纯化的CDV-F蛋白免疫小鼠,通过采集小鼠血清进行间接ELISA分析,小鼠血清的抗体滴度达到10-5,说明原核表达的CDV-F蛋白具有良好的免疫原性。2.单克隆抗体的制备、纯化与HRP标记用纯化的CDV-F作为抗原,免疫BALB/c小鼠,利用传统的细胞融合与亚克隆技术成功制备了三株单克隆抗体1A5,1A5和7D5,通过向腹腔注射杂交瘤细胞制备单克隆抗体,收集腹水通过Protein G亲和层析进行纯化,浓度分别为1.2 mg/mL,1.2 mg/mL,1.8 mg/mL。然后用氧化还原法标记HRP,直接ELISA方法检测三株抗体的效价为1∶100000-1∶1000000。3.犬瘟热病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立首先利用犬瘟热病毒作为抗原,通过竞争ELISA对单克隆抗体抗原表位进行分析,结果显示,三株单克隆抗体均识别不同的表位,通过捕获抗体与检测抗体的确定,结果显示1A5作为捕获抗体,7D5-HRP作为检测抗体时检测病P/N值最高,非特异性反应最弱,然后通过棋盘滴定法确定了双抗体夹心ELISA方法的最佳反应条件,其中捕获抗体包被量为800 ng/孔、HRP-7D5稀释比例为1∶100。4.敏感性评价:用现有的商品化试纸条与双抗体夹心ELISA方法分别犬瘟热病毒感染的vero细胞的上清。结果显示,两种方法均能检测到logTCID50=1.8的病毒样本,上述结果说明,建立的双抗体夹心ELISA方法的敏感性与现有的商品化试纸条相同。5.特异性评价:利用CPV（犬细小病毒）、ICHV（犬传染性肝炎病毒）、CPIV（犬副流感病毒）三种病毒感染细胞的上清来评价双抗体夹心ELISA方法的特异性。结果显示,CPV、ICHV、CPIV细胞培养的上清均不反生反应,因此本方法具有良好的特异性。6.与商品化试纸条一致性评价:13份临床大熊血清与30份临床犬血清分别用商品化试纸条与建立的双抗体夹心ELISA方法检测,临床大熊猫血清中均没有检到犬瘟热病毒,临床犬血清两种方法均检到6份阳性,两种方法的一致性为100%,说明双抗体夹心ELISA方法与现有的商品试纸条一致性高。综上所述,本课题建立了一种快速检测犬瘟热病毒的双抗体夹心ELISA方法,与商品化试纸条具有很高的一致性,可以用来检测犬瘟热病毒。