禽病原性大肠杆菌E058株和尿道致病性大肠杆菌U17株neuC、proP基因突变株的构建及其致病性评价

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禽大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌(avianpathogenicEscherichiacoli,APEC)引起的一种常见的局部或全身性感染的细菌性传染病,且易与其它病原性细菌、病毒并发或混合感染。目前,该病已成为危害养禽业的重要细菌病,给养禽业带来严重威胁和造成重大经济损失。   尿道感染(urinarytractinfections,UTIs)在人类疾病中是比较常见的,大部分妇女都会经历一次尿道感染。迄今,尿道致病性大肠杆菌(uropathogenicEscherichiacoli,UPEC)是尿道感染中最常见的病原体。UPEC通过自身所带的毒力因子黏附并侵入宿主,突破宿主的防御系统,引起组织的损伤。UPEC在肠道外的生长能力使得它们能引起尿道感染在内的各种疾病。   基于APEC和UPEC的致病潜能,APEC和UPEC被归为新型致病性大肠杆菌—肠道外病原性大肠杆菌(extraintestinalpathogenicEscherichiacoli,ExPEC)。由于APEC和UPEC在肠道外感染中可能会面临宿主相似的挑战,它们可能具有某些相似的致病基因和致病能力。很多研究证明,APEC和UPEC的毒力因子之间存在着一定的相似性。   我们之前的研究利用DNA芯片分别对APECE058株和UPECU17株在鸡体内和体外的转录子进行了分析,结果显示neuC基因呈显著上调趋势,同时我们通过选择性捕获转录序列方法得出proP基因可能跟致病性相关。因此,本研究中选择构建neuC和proP这两个基因的突变株并评价其与致病性之间的关系。   运用Red重组系统构建E058△neuC、U17△neuC、E058△proP、U17△proP基因缺失突变株。Southernblot结果显示Kanamycin和Zeocin抗性基因在E058△neuC、U17△neuC和E058△proP、U17△proP质粒中的插入是单拷贝的;RT-PCR结果表明E058△neuC和U17△neuC的neuC基因不能转录,E058△proP和U17△proP的proP基因不能转录,而相关基因的上下游基因的转录并未受影响。在血清杀菌实验中,与野生株E058和U17相比,E058△neuC和U17△neuC在血清中的存活率下降(P<0.05),而E058△proP和U17△proP与野生株相似。巨噬细胞HD11的吞噬结果显示,与野生株E058和U17相比,E058△neuC和U17△neuC突变株的吞噬率显著升高,而E058△proP和U17△proP突变株的吞噬率跟野生株相当。体内竞争结果表明,在35日龄的SPF鸡体内,与野生株E058、U17相比,突变株E058△neuC和U17△neuC竞争性生长能力显著下降(P<0.001或P<0.0001),说明突变株被高度致弱,但是E058△proP和U17△proP突变株和野生株E058和U17相比没有差异。体内动态分布实验中,E058△neuC和U17△neuC突变株在受检脏器中的细菌数较APECE058株和UPECU17株均明显下降,其中在心、肝、脾、肾中下降特别明显(P<0.0001),在肺中下降也很明显(P<0.001),而E058△proP和U17△proP突变株在受检脏器中的细菌数与APECE058株和UPECU17株类似。上述结果显示,neuC基因与APECE058株和UPECU17株的致病性有较强关联,而proP基因与APECE058株和UPECU17株的致病性无关。
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