研究背景子宫内膜异位症是一种主要发生在育龄期妇女的常见妇科疾病。它表现出来的盆腔疼痛和不孕等临床症状已经严重影响了现代女性的身心健康。近年来日益受到研究者的广泛关注。子宫内膜异位症的发病率在普通人群中为10％-15％。目前确切的病因和病理机制仍不清楚。经典的病因学说有内膜种植学说、体腔上皮化生学说、淋巴回流学说和免疫学说等，近年来认为遗传和环境因素也同样影响了子宫内膜异位症的易感性。子宫内膜异位症虽是一种良性疾病，但却表现出与恶性肿瘤相似的生物学特性，如细胞的非典型性增生、浸润、转移、新生血管形成及遗传的不稳定性等等。目前已经将其视为一种“特殊的肿瘤”。研究证实，子宫内膜异位症的发病机制具有多步骤类似肿瘤的形成过程，已从分子水平上揭示了子宫内膜异位症和肿瘤的相似性。研究发现，子宫内膜异位症与卵巢癌的发生高度相关，甚至被很多学者认为是卵巢癌的癌前病变。众所周知，肿瘤的主要特征是增生和恶性转化。而细胞增生和恶性转化都是控制细胞分裂(即细胞周期)异常引起的后果。研究证实，CyclinB1/Cdc2及PLK1是控制细胞周期的2个关键性调节因子，在肿瘤的增生和恶性转化过程中起了重要作用。已经在多种肿瘤组织中发现有CyclinB1/Cdc2及PLK1的表达异常。正因为子宫内膜异位症与肿瘤有着诸多的相似之处，因此我们不难想到，这些细胞周期调节蛋白是否也在子宫内膜异位症的患者中表达异常而且在其发病中起了某种重要作用呢?目前对一些在细胞周期调节中控制G1/S期转化的细胞周期蛋白与子宫内膜异位症的关系已经有了一些研究，如CyclinA、CyclinD和CyclinE等，但是对细胞周期调节中控制G2/M期转化的细胞周期蛋白与子宫内膜异位症的相关性研究目前尚未见报道。因此，为了进一步探讨细胞周期蛋白及其调节蛋白与子宫内膜异位症发生的相关性，我们采用RT—PCR技术、免疫印迹法、免疫组织化学、细胞培养结合细胞生长计数、细胞周期分析和细胞分裂指数检测等方法，检测了CyclinB1/Cdc2和PLK1基因及蛋白在子宫内膜异位症患者的在位和异位内膜以及正常人子宫内膜组织中的表达及CyclinB1/Cdc2和PLK1与子宫内膜异位症患者子宫内膜细胞增殖间的关系。本研究是国际上首次对CyclinB1/Cdc2和PLK1与子宫内膜异位症发生的相关性进行研究和报道，目的是探讨子宫内膜异位症的病理发生机制，为寻求子宫内膜内异症新的预防和治疗方法提供思路。第一部分子宫内膜异位症患者子宫内膜细胞与正常人子宫内膜细胞体外生长特性的比较目的：通过比较子宫内膜异位症患者异位及在位内膜细胞与正常人子宫内膜细胞体外生长特性的比较来探讨子宫内膜异位症的发病机理。材料与方法：取因子宫内膜异位症行开腹或腹腔镜手术的内异症患者异位内膜21例，同时取行开腹手术的内异症患者在位内膜6例，对照组因子宫浆膜下肌瘤行开腹手术切除子宫的正常女性在位子宫内膜6例。患者年龄21-47岁，术前6个月未用过激素治疗，无全身性合并症。采用体外细胞培养结合细胞生长计数和细胞分裂指数计数的方法对三组子宫内膜细胞的体外生长特性进行比较。结果：体外培养细胞生长计数和有丝分裂指数检测实验结果均显示：自种植后第2天开始，内异症异位和细胞在位内膜的生长速度较正常人子宫内膜细胞明显增快，第2天开始到第4天增长最快，与正常人子宫内膜细胞相比具有显著性差异(P＜0.05)。第五天细胞生长达到平台期。内异症异位内膜细胞与其在位内膜细胞相比，生长速度没有显著性差异(P＞0.05)。结论：子宫内膜异位症患者在位及异位内膜有着与正常人子宫内膜不同的增殖能力，这种增高的细胞增殖能力可能是子宫内膜异位症发生的病理基础，可能与异位内膜在腹腔中的粘附、存活及生长有关。第二部分CyclinB1、Cdc2及Polo-like kinase1在子宫内膜异位症患者子宫内膜组织中的表达目的：通过细胞周期调节蛋白CyclinB1及其调节蛋白Cdc2以及Polo-like kinase1(PLK1)在子宫内膜异位症中的表达，探讨CyclinB1/Cdc2和PLK1在子宫内膜异位症发生中的作用。材料与方法：子宫内膜异位症患者(以下简称内异症)异位内膜29份(增生期17份、分泌期12份)，同时获取内异症在位内膜20份(增生期11份、分泌期9份)。正常人子宫内膜30例(增生期16份、分泌期14份)。采用RT-PCR、蛋白免疫印迹(Western blotting)以及免疫组织化学的方法检测上述三组子宫内膜组织中CyclinB1、Cdc2以及PLK1的表达。同时检测了Ki-67在三组子宫内膜组织中免疫组化的表达。采用直线相关分析法对Ki-67免疫组化的表达结果与CyclinB1和PLK1的蛋白表达水平进行相关分析。结果：RT-PCR和Western blotting实验结果证明，在月经周期的增生期和分泌期，内异症异位和在位内膜组织上CyclinB1和PLK1 mRNA和蛋白质水平的表达量均明显高于正常妇女在位子宫内膜上的表达(P＜0.05)。异位内膜上的表达量也高于其在位内膜，但是没有达到统计学差异(P＞0.05)。在整个月经周期中，增生期CyclinB1和PLK1 mRNA和蛋白的相对表达水平高于分泌期。Cdc2在整个月经周期三组子宫内膜组织上mRNA和蛋白质的相对表达水平都基本恒定(P＞O0.05)。免疫组化染色的结果：CyclinB1、Cdc2以及PLK1在细胞核和细胞浆中都有表达，CyclinB1和PLK1的染色强度由强到弱依次为子宫内膜异位症异位内膜、在位内膜及正常人子宫内膜组织。在整个月经周期，子宫内膜异位症患者的在位和异位内膜组织上Ki-67免疫组化的阳性表达率明显高于正常人子宫内膜组织(P＜0.05)。三组子宫内膜组织中增生期Ki-67的表达都高于分泌期。染色强度由强到弱依次为内异症异位内膜组织、内异症在位子宫内膜组织和正常人子宫内膜组织。而异位症异位和在位内膜组织上Ki-67的阳性表达率没有显著差异(P＞0.05)。Pearson直线相关分析结果显示：三组子宫内膜组织上Ki-67的表达量与第一部分实验中CyclinB1及PLK1在三组组织中的蛋白表达量呈正相关关系(相关系数r分别为0.701和0.752)。结论：CyclinB1和PLK1在子宫内膜异位症患者的异位和在位子宫内膜组织上mRNA和蛋白质的表达水平均高于正常人子宫内膜组织。Ki-67在三组子宫内膜组织中免疫组化的阳性表达率与CyclinB1及PLK1的蛋白表达有较好的相关性。因此CyclinB1和PLK1可能参与了子宫内膜异位症的病理发生，而且可能和Ki-67一样，都可以用来预测子宫内膜细胞的增殖能力。第三部分：CyclinB1/Cdc2抑制剂Alsterpaullone对子宫内膜异位症患者子宫内膜细胞体外生长的影响目的：进一步证明CyclinB1/Cdc2在子宫内膜异位症患者子宫内膜细胞增殖中的作用，以期寻找治疗子宫内膜异位症的新途径和新方法。材料与方法：材料获取的方法及数量同第一部分，三组子宫内膜细胞分别设置处理组和对照组。采用细胞培养结合细胞分裂指数计数、噻唑蓝比色法(MTT)、蛋白免疫印迹及流式细胞仪细胞周期分析等方法检测了给Alsterpaullone(Alp)前后三组子宫内膜细胞的体外生长情况及CyclinB1和PLK1的蛋白表达量的变化。结果：MTT结果显示：当Alp浓度0-3mM/L作用1小时，三组细胞对Alp的抑制效果没有明显差别，当Alp浓度为5.0mM/L及10.0mM/L浓度时，三组子宫内膜细胞的生长与对照组细胞相比都受到了明显抑制(P＜0.05)，异位症患者异位内膜细胞的生长受抑制率分别为43.67％和53.59％；异位症在位内膜细胞生长受抑制率分别为38.12％和41.81％；正常人子宫内膜细胞生长受抑制率分别为32.14％和33.30％。子宫内膜异位症患者的异位和在位内膜细胞的生长受抑制率要大于正常人子宫内膜细胞。当给细胞以Alp浓度为5.0mM/L作用24h、48h及72h时，异位症异位及在位内膜细胞的生长及CyclinB1和PLK1蛋白的表达都受到了显著抑制(P＜0.05)。而正常人子宫内膜的生长只是在24h是有较明显的抑制(p＜0.05)，但是48h及72h后细胞的生长及CyclinB1和PLK1蛋白的表达与对照子宫内膜相比却没有显著差异(P＞0.05)。内异症异位内膜细胞受Alp分别作用24h、48h及72h时后，细胞的生长及CyclinB1和PLK1蛋白表达受抑制率要大于其在位内膜细胞，但是差异都没有达到统计学水平(P＞0.05)。结论：CyclinB1/Cdc2在调控子宫内膜异位症患者在位和异位内膜细胞的增殖生长中起了重要作用。临床中将来有可能利用抑制剂Alp来达到治疗或辅助治疗子宫内膜异位症的作用。第四部分PLK1 siRNA小分子对子宫内膜异位症患者子宫内膜细胞体外生长的影响目的：进一步证明PLK1在子宫内膜异位症患者在位和异位内膜细胞增殖中的作用，以期寻找治疗子宫内膜异位症的新途径和新方法。材料与方法：材料的获取方法及数量同第一部分。针对人类PLK1基因为靶位点设计合成siRNA片段，以慢病毒为载体，对子宫内膜异位症在位、异位子宫内膜细胞及正常人子宫内膜细胞感染48h(三组细胞分别设置处理组和对照组)，观察三组细胞病毒感染前后细胞的体外生长变化及CyclinB1和PLK1蛋白表达量的变化。采用的方法有流式细胞仪细胞生长周期分析及蛋白免疫印迹技术。结果：在给病毒感染后48h时，PLK1基因敲除后的子宫内膜异位症在位和异位细胞CyclinB1和PLK1的蛋白表达量及细胞生长与对照细胞相比都受到了显著抑制(P＜0.05)。流式细胞仪细胞生长周期分析结果显示：内异症在位和异位内膜细胞的细胞生长在G2/M期受到了明显阻滞(P＜0.05)，G2/M期的细胞数分别达到了35.10％和24.21％，细胞G2/M期阻滞率分别为79.15％和71.21％(P＜0.05)。而正常人子宫内膜细胞与对照组细胞相比，细胞的生长却并没有受到明显影响，没有发现明显的G2/M期阻滞，G2/M期的细胞数仅为8.12％，G2/M期阻滞率为26.23％(P＞0.05)。蛋白免疫印迹结果显示：内异症在位和异位内膜细胞上CyclinB1和PLK1蛋白表达量都受到了明显抑制。内异症异位内膜上CyclinB1和PLK1蛋白表达量分别下降了89.21％和90.39％(P＜0.05)；异位症在位内膜上CyclinB1和PLK1的蛋白表达量分别下降了68.78％和74.55％(P＜0.05)，差异具有统计学意义(P＜0.05)。而正常人子宫内膜细胞上CyclinB1和PLK1蛋白的表达量并没有显示出显著变化(P＞0.05)。结论：PLK1 siRNA对子宫内膜异位症患者的子宫内膜PLK1基因表达具有明显的消除作用，在细胞水平上显著抑制了异位症内膜细胞的分裂和生长。siRNA敲除PLK1将来有可能成为治疗子宫内膜异位症新的分子靶位点。