肝癌细胞miR-183的表达及上下游调控机制的探讨

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目的:MiRNA在肝肿瘤的发生发展中发挥着重要作用。其中,miR-183的显著上调已成为临床肝肿瘤发生的普遍特征,但其在肝癌发生中的分子机制亟待阐明。本研究旨在探讨肝癌细胞Hep3B,H-ras12V转基因小鼠肝肿瘤组织中miR-183的表达及其上游调控机制和下游靶标蛋白变化。方法:1.MTT法检测人正常细胞株LO2及人肝癌细胞株Hep G2、Hep3B的细胞增殖活性。2.提取细胞的总RNA和蛋白,采用RT-q PCR和蛋白印迹法分别检测细胞株、小鼠肝组织中miR-183的表达和细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)、磷酸化胞内磷脂酰基醇激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、NF-κB抑制蛋白α亚基(IκBα)的蛋白表达水平、程序性细胞死亡因子4(PDCD4)的蛋白水平。3.用Anti-ERK(PD184352)、Anti-PI3K(LY294002)、Anti-AKT(MK2206)、Anti-NFk B(BAY11-70829)分别抑制Hep3B细胞ERK、PI3K、AKT、NF-ΚB信号分子的活性并检测miR-183的表达水平及PDCD4蛋白的表达水平。4.Illumina法对正常肝组织、肿瘤周围组织、肝肿瘤组织中的miRNA表达水平进行测序分析。结果:1.MTT法检测细胞增殖的实验结果显示,LO2、Hep G2、Hep3B细胞在48 h的增殖倍数分别为8.76±0.22、16.61±1.59和19.86±0.69,差异有统计学意义,F=159.90,P<0.001。与LO2(41.68±9.62)和Hep G2(41.53±1.20)细胞相比,Hep3B(69.15±11.02)细胞表达水平显著升高,F=10.250,P=0.012。2.RT-q PCR法检测细胞中miR-183的表达水平,实验结果显示,与LO2(41.68±9.62)和Hep G2(41.53±1.20)细胞相比,Hep3B(69.15±11.02)细胞的miR-183的m RNA表达水平显著增高,差异有统计学意义。F=10.250,P=0.012。3.蛋白免疫免疫印迹法检测细胞中信号分子蛋白水平的结果显示,与LO2相比,Hep3B细胞的p-ERK1、ERK1、p-AKT、IκBα的蛋白水平明显升高,分别为LO2的10.87、24.68、6.67和1.92倍;PDCD4的蛋白水平明显降低,为LO2的0.14倍。与LO2细胞相比,Hep G2细胞的IκBα和PDCD4蛋白表达明显升高,分别为LO2的4.46和7.90倍。4.用Anti-ERK(PD184352)、Anti-PI3K(LY294002)、Anti-AKT(MK2206)、Anti-NFk B(BAY11-70829)分别抑制Hep3B细胞ERK、PI3K、AKT、NF-ΚB信号分子的活性12 h.24 h后,RT-q PCR法检测细胞中miR-183的表达水平,结果显示,抑制ERK的活性后12 h和24 h,miR-183表达水平显著上升,F=215.459,P<0.001;抑制Hep3B细胞的PI3K活性后12 h和24 h,miR-183表达水平显著降低,F=80.215,P<0.001;抑制AKT的活性后12 h和24 h,miR-183表达水平显著下降,F=101.947,P<0.001;抑制NF-κB的活性后12 h和24 h,miR-183表达水平没有显著变化,F=1.826,P=0.2165.用Anti-ERK(PD184352)、Anti-PI3K(LY294002)、Anti-AKT(MK2206)、Anti-NFk B(BAY11-70829)分别抑制Hep3B细胞ERK、PI3K、AKT、NF-ΚB信号分子的活性24 h和48 h后,蛋白免疫免疫印迹法检测PDCD4蛋白的表达水平,结果显示,抑制ERK和NF-κB信号分子活性对PDCD4的蛋白表达没有显著影响。抑制PI3K信号分子活性后,PDCD4的蛋白表达水平在24 h明显升高,在48 h无显著变化。抑制AKT信号分子活性后24 h和48 h,PDCD4的蛋白表达水平均明显升高。6.高通量miRNA表达测序分析与RT-q PCR验证结果表明,与正常肝组织和肿瘤周围组织相比,肝肿瘤组织中的miR-183的表达量水平显著升高(P<0.05)。7.蛋白印迹结果表明,与正常肝组织和肿瘤周围组织相比,肝肿瘤组织中的P-ERK、P-PI3K、P-AKT蛋白表达水平明显升高,而IKB、PDCD4的蛋白表达明显降低。结论:在Hep3B细胞中,PI3K/AKT对miR-183的表达有显著的促进作用,而ERK对miR-183的表达有显著的抑制作用,NF-κB不是调控miR-183表达的主要信号分子。PDCD4是miR-183的重要下游靶蛋白。上述分子表型在H-ras12V转基因肝癌小鼠中得到了初步验证。
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